多肽类药物结构稳定性的研究进展

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1、380 中国医药生物技术 2007 年 10 月第 2 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2007, Vol. 2, No. 5 综述 多肽类药物结构稳定性的研究进展 高德民，刘金锋，王凤山 多肽作为药物，具有生理活性强、免疫原性低、疗效高 等诸多优点， 随着生物技术的不断发展， 其在人类疾病治疗 中的地位也日趋重要， 目前已成为国际药学界研究的热点之 一。但多肽类物质自身固有的特点，如口服利用率较低、酶 降解性高以及半衰期极短等， 使其作为药物开发应用受到诸 多的局限。 而导致多肽类药物不稳定的一个重要原因就是多 肽特殊的分子结构， 其中多肽主链氨基酸的

2、降解和侧链氨基 酸残基的结构变化是多肽结构不稳定的主要原因， 因此从多 肽类药物本身的分子结构进行改造， 是改变其理化性质和药 代动力学性质的根本。 本文拟重点从分子结构改造方面对多 肽类药物稳定性的研究进展做一综述。 1 化学修饰 化学修饰不仅是多肽类药物定向改造、 提高稳定性的有 力工具， 也是研究多肽结构与功能的一种重要手段。对多肽 的主链基团和侧链基团都可以进行化学修饰。 主链基团修饰 包括氨基酸肽链的延长、 切除及氨基酸定位突变等；侧链基 团修饰主要集中于氨基、 巯基和羧基上。 修饰剂主要有葡聚 糖、多聚唾液酸、聚乙二醇、四硝基乙烷等。根据修饰剂与 多肽之间反应的性质， 修饰反应可分

3、为糖基化反应、酯化反 应、酰化反应、取代反应、磷酸化反应、烷基化反应、氧化 还原反应等。 由于烷基化反应和氧化还原反应对多肽的活性 影响较大， 实际应用较少， 而磷酸化反应对多肽稳定性的影 响意义不大。现主要对前 4 种修饰反应进行重点介绍。 1.1 糖基化反应 糖基化是指多肽的氨基和单糖还原端的羰基在温和的 条件下经过一系列变化成为较稳定的糖肽的过程， 是一种较 为理想的稳定多肽类药物的方式， 糖链的存在及其结构的可 变性、 复杂性和多样性直接影响着糖肽在组织中的降解和在 体内的寿命1，也使得糖肽成为药学研究的新热点。脑内的 亮氨酸脑啡肽可特异性地与阿片受体结合， 在机体内起着调 控痛觉感受

4、并调节心血管与胃肠功能的作用，但半衰期短。 Roscic 等2用葡萄糖对亮氨酸脑啡肽进行修饰后， 其稳定性 显著增强， 而且二者形成的咪唑啉酮复合物可有效阻止血浆 中酶的降解。 1.2 酯化反应 酯化是指多肽的羧基和醇羟基形成较稳定的酯类化合 物的反应。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是常用的 酯化反应试剂，是一种线性、亲水、灵活而不带电的高分子 聚合物。通常选择相对分子质量大于 10 000 的 PEG 在 温和的条件下对多肽进行修饰，选择合适的修饰类型、修 饰程度以及修饰位点有利于改善多肽类药物的活性并提 高其稳定性。目前已有不少经 PEG 修饰的多肽类药物如 P

5、EG-IL-23、PEG-水蛭素4等已进入临床试验阶段。2006 年， Pan 等5用 PEG 修饰胰高血糖素样肽-1 （GLP-1） 的 C 端后，GLP-1 的活性和稳定性都得到了较大的提高。 1.3 酰化反应 酰化是指在多肽分子上导入酰基使之成为酰化肽的过 程。酰化试剂多为氨甲酸、乙酸酐、酰氯等物质，经酰化反 应修饰的多肽稳定性通常都有较大提高。Ligeti 等6在痛敏 肽（nociceptin）的 N 端用氨甲酸修饰后，其活性和稳定性 均有明显提高。Zobel 等7把系列磷酸酯连接在与抗凝血肽 相结合的白蛋白上，经耳缘静脉注射于家兔体内，结果显示 抗凝血肽的半衰期延长了近 50 倍，但

6、实验也表明，酰化肽 常存在生物利用度不高等问题而影响其在多肽类药物中的 推广使用。 1.4 取代反应 天然多肽由 L-氨基酸组成，稳定性较差。据此可以选 择结构类似而对酶不敏感的氨基酸如 D-氨基酸、羟基氨基 酸、甲基化氨基酸、杂环氨基酸或烷基等取代相应的 L-氨 基酸，通常既能减少对活性中心的影响，又能有效提高多肽 类药物的稳定性。 Chen 等8比较了 D-型与 L-型的 螺旋 抗菌肽 ， 发现二者抗菌活性一致， 但 D-型对胰蛋白酶不 敏感，稳定性较好。Boeglin 等9在研究黑皮质激素受体拮 抗剂中的一段序列 Ac-His-D-Phe-Arg-Trp 时，发现以氮杂 环氨基酸取代 C

7、 端 Trp 能有效抑制酶的降解， 提高代谢稳 定性。而 DUrsi 等10在合成一种拮抗猫免疫缺陷病毒的八 肽 Ac-Trp-Gln-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile 时，发现肽中 Trp-rich 基序用适当长度的简单烷基替换后， 其抑制活性和稳定性都 有较大的提高。 2 延长肽链 延长肽链也称分子末端修饰。 稳定小分子线性肽链结构 的驱动力主要来自主链与主链间及侧链与侧链间的静电作 用，所以在一定肽链范围内从 N 端或 C 端延长肽链，可 加强静电作用进而提高多肽的稳定性。例如，在酵母蛋白酶 传染性因子（Sup-35）中的七肽片段 Gly-Asn-Asn-Gln-Gln-

8、Asn-Tyr 的 N 端，逐级连接二肽或三肽片段，随着肽链的 延长， 所形成的寡聚物的稳定性也不断增强11。 在神经六肽 作者单位：250012 济南，山东大学国家糖工程技术研究中心，山东大 学药学院生化与生物技术药物研究所 通讯作者：王凤山，Email： 收稿日期：2007-07-17 中国医药生物技术 2007 年 10 月第 2 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2007, Vol. 2, No. 5 381 Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys 的 N 端和 C 端分别连接 D-Phe 和 Thr 后，其活性和稳定性较天然六肽均明显

9、增强12。沿 肽链骨架延长对酶不敏感或对热较稳定的氨基酸序列， 从而 抑制氨肽酶和羧肽酶从 N 端或 C 端的降解，对多肽类药 物和酶类药物稳定性的研究都有非常重要的意义13。 3 基因工程改变 基因工程是近 30 年来发展起来的一项成熟的生物技 术。 利用基因工程技术将特定目的多肽与稳定性较好的蛋白 质进行融合、 表达和纯化， 或者借助基因工程手段消除多肽 中不稳定的残基，可达到改善多肽类药物结构稳定性的效 果，提供具有医药意义的优良性状的蛋白质或多肽。 3.1 融合蛋白 将稳定性与活性较好的蛋白质与多肽类药物进行融 合，可以有效地提高多肽类药物的稳定性和活性。例如， 酵母表达的血清白蛋白-

10、干扰素- 融合蛋白（HSA-IFN-） 在短尾猴体内的半衰期就比单独的 IFN- 延长了大约 18 倍14，若 HAS 和 IFN- 间借助 GGGGS 序列连接，则 融合蛋白的稳定性更强15。同样的 HSA-CD4 融合蛋白在 以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的 CD4 也延长 了约 140 倍16。 但利用基因工程技术制备融合蛋白时需要 考虑蛋白单体彼此间的结构关系，尤其是融合蛋白对活性 中心的影响程度，否则可能出现稳定性提高而活性降低甚 至丧失的结果。 3.2 诱变 诱变是基因工程中研究基因表达、 蛋白质结构和功能关 系的有力工具， 通过诱变技术替换多肽中不稳定的残基或引 入能增加多

11、肽稳定性的残基， 提高多肽的稳定性。 诱变可分 为定向诱变、随机诱变和 DNA 重组。如天蚕抗菌肽和蜂 毒肽的杂种肽 Pep3，具有较强的抗菌活性，Ferre 等17在 研究中发现，用 Lys 和 Phe 分别替代 Trp 和 Val 后的杂 种肽 Pep3 类似物具有杀菌活性更高、细胞毒性更小和对 蛋白水解酶敏感性更低的优点。但诱变前需要了解多肽的 结构基序和功能基序，熟悉功能基序的变化规律，否则易 导致诱变后维持多肽二级结构的各种作用力丧失而稳定性 降低18。 4 形成环肽 环肽是相对于直线肽链而言的， 具有生物活性的环肽通 常具有明确的限制性构象， 能够与受体很好地契合。由于分 子内没有

12、游离的 N 端和 C 端，环肽对于氨肽酶和羧肽酶 的敏感性大大降低19。与直线肽链相比，环肽在抗真菌和 杀灭肿瘤细胞等方面都表现出天然的优势20。将直线肽链 形成环肽，或者在具活性的直线肽链上连接一个环肽单元， 往往可使多肽的活性和稳定性都得到明显提高。 如细胞黏附 肽 Arg-Gly-Asp 用于器官手术时，在促进增生方面作用显 著， 但易降解及缺乏选择性， 通过在该肽链上连接双吖乙二 醇（diazaethyleneglycol）衍生物形成环状结构后，不但能同 样抑制结合纤维蛋白原和纤维结合蛋白的能力， 而且稳定性 也有所提高21。Arg-Gly-Asp-Val-Tyr 能抑制人白血病细胞

13、K562 与纤维结合蛋白的黏连，Siemion 等22在该肽链的两 端借助 Cys 连接形成含二硫键的环七肽后，其抑制活性明 显增强。 根据环合方式，环肽可分为首尾相连环肽、侧链与侧链 相连环肽23、 侧链与端基相连环肽24、 含二硫桥的环肽25-26 以及其他桥连结构的环肽27-29。环合产物构象的改变，可使 其活性发生较大改变。如胸腺五肽变为环状七肽后，活性明 显降低30。吗啡肽的环状类似物 H-Tyr-cD-Cys-Phe-Cys NH2 与 H-Tyr-cD-Cys-Phe-D-CysNH2 分别是阿片受体 和 的拮抗剂，用二甲基（-CH2-CH2-）或顺二亚甲基（-CH = CH-）

14、替代二硫键形成环肽后，其类吗啡肽的活性明显减 弱31。Tamilarasu 等32通过计算机模拟构象发现，肽链在 环合前后构象变化越小， 对直线肽链的生物活性保持就越有 利，而应用侧链成环对肽链的构象影响最小，据此他运用正 交保护法合成了六元环肽，取得了理想的效果。总之，环肽 独特的结构使之在多肽类药物结构稳定性的研究中备受关 注，有广阔的开发和应用前景。 5 结语 目前，多肽类药物结构稳定性研究的新技术、新方法 日新月异，新成果也不断涌现。经化学修饰的多肽其分子 性质发生了改变，在体内的作用时间延长，保留甚至提高 了生物学活性，在很大程度上拓宽了多肽类药物的应用范 围。但是，化学修饰也存在着

15、修饰后药物活性降低、稳定 性不够理想等突出问题，因此寻找合适的修饰位点，保持 持续、有效的生物活性是多肽化学修饰未来研究的主要方 向。通过延长肽链常能使小分子多肽的稳定性显著提高， 所选择对象应是对酶或外界不敏感的氨基酸序列，但因其 多用于小分子的多肽，所以适用范围较窄。通过基因工程 表达的多肽，在稳定性和活性方面常有意外收获，是新药 研发的重要方向，具有广阔的市场前景，但融合多肽的表 达量以及下游纯化技术还有待成熟，而通过化学修饰与基 因工程相结合，在提高多肽稳定性方面将会发挥更大的作 用。对于环肽，应多考虑成环后结构的变化对多肽类活性 的影响，寻找高效的环肽合成方法，努力做到准确地进行 分

16、子设计，以确保环肽的活性和稳定性。 参考文献 1 Zhu LP. Protein glycosylation and B cell immunity. Shanghai J Immunol, 2001, 21(4):193-194. (in Chinese) 朱立平. 蛋白质糖基化与 B 细胞免疫. 上海免疫学杂志, 2001, 21(4):193-194. 2 Rosci M, Horvat S. Transformations of bioactive peptides in the presence of sugars-Characterization and stability studies of the adducts generated via the Maillard reaction. Bioor