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1、1厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与-氨基丁酸的关系【关键词】 厚朴酚；,脑缺血再灌注；,-氨基丁酸；,谷氨酸摘要：目的研究厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与 氨基丁酸（GABA）的关系。方法采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，用高效液相荧光法测定大鼠脑组织谷氨酸（GLU）和 GABA 的含量。结果厚朴酚可以明显降低脑缺血再灌注后 GLU 含量，增加 GABA 的含量。结论 厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，该作用与其提高抑制性氨基酸 GABA的含量，产生抑制性保护作用有关。关键词：厚朴酚； 脑缺血再灌注； -氨基丁酸； 谷氨酸 Neurop
2、rotective Effect of Magnolol against Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury and the Relation to GABA in RatsAbstract：Objective To study the protective effect of magnolol against focal cerebral ischemia-reperfusion injury and the relation to gamma- aminobutyric acid （GABA）in rats. MethodsThe midd
3、le cerebral artery occlusion(MCAO) model in rats was established to investigate the role of magnolol. The levels of glutamate (GLU) and GABA in cerebral tissue were measured by high performance liquid chromatography-fluorometer (HPCLFR) method. ResultsThe levels of GLU markedly decreased while the l
4、evels of GABA obviously increased by magnolol in MCAO rats.ConclusionMagnolol could prevent MCAO rats from ischemia-reperfusion injury, the pretective effect is related to magnolol keeping dynamic balance of excition-inhibition ,and persisting inhibitiondepended effect.Key words：Magnolol; Cerebral i
5、schemia-reperfusion injury; Gama-aminobutyric acid; Glutamate缺血性脑血管疾病是临床常见、多发且预后较差的疾病。脑缺血再灌注损伤的机理非常复杂，目前研究提出的兴奋抑制失衡假说认为：脑缺血时脑内 氨基丁酸(aminobutyric acid,GABA)的含量进行性下降，内源性抑制作用降低，兴奋性毒性增加，引起兴奋抑制失衡，是脑缺血损伤的重要因素之一1 。另有报道，GABA 及其拟似剂可以治疗脑缺血后因兴奋性氨基酸大量释放引起大脑的神经损伤2 。因此抑制性神经递质可能成为临床防治脑缺血损伤新的靶点。厚朴酚(magnolol)是中药厚朴的主
6、要活性成分，有报道3对脑缺血有保护作用。另有研究发现厚朴酚在体外对 GABAA 受体有激动作用4 。但有关厚朴酚对脑缺血再灌注损伤保护作用与 GABA 的关系的研究目前国内外还没有报道。本实验采2用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，观察厚朴酚对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与 GABA 的关系。1 材料与方法1.1 主要药品和试剂厚朴酚由重庆医科大学药学院提供，纯度90。甲醇(色谱醇)购自上海凌峰化学试剂厂。谷氨酸 (GLU)和 GABA 标准品购自上海试剂三厂。1.2 主要仪器美国惠普公司 HP1050 型高效液相色谱仪
7、。德国 BeckmanJ221型高速离心机。1.3 实验动物分组及给药方法 40 只健康清洁级 Wistar 大鼠，体重为（30020）g，雌雄不限，购自重庆医科大学实验动物中心。随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、小剂量厚朴酚预处理组、大剂量厚朴酚预处理组，每组10 只。其中厚朴酚预处理组于实验前 3 d 开始灌胃给药，给药剂量分别为 25 mg/kg 和 75 mg/kg。1.4 大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的制作 参照 Longa 等5的线栓法，用 10水合氯醛(4 ml kg1，ip)麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠仰卧位固定，消毒皮肤，铺无菌孔巾，颈正中切口，分离左侧颈总动脉，颈外动脉，
8、颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉切口处向颈内动脉插入栓线约(18.50.5) mm，感觉有阻力即达大脑中脉起始部，完全阻断其血流，结扎颈内动脉。2 h 后拔出栓线，再灌注 24 h，即造成缺血再灌注模型。所用栓线为直径 0.2 mm 尼龙渔线，头段烧圆，顶端直径约0.250.28 mm。术中室温在（270.5）。术后缝合伤口，动物回笼。术中保持肛温恒定。动物清醒后出现以左前肢偏瘫为主的神经功能缺失表现为模型成功的标志。凡呼吸困难、术中出血量较大、术后 30 min 仍未苏醒者均弃之不用。假手术组除了不插栓线外，其余步骤同手术组。1.5 标本处理全部大鼠剪断头部，迅速取脑，在冰盘
9、上分离缺血侧脑组织，电子天平准确称重，即刻冻存在-20冰箱。取脑组织于匀浆器内用甲醇反复充分溶浆 3 次，转移合并提取液至离心管内，置超声波上处理 30 min，10 000 rmin1，10以下冷冻离心 30 min，将上清液转入液闪瓶内，80水浴使甲醇蒸发干,瓶内准确加入 1.35 ml 0.1molL1 的 HC1，再超声处理 30 min，使氨基酸充分溶出。将溶出物再次冷冻离心 30 min，取上清液用于氨基酸分析。1.6 氨基酸分析 色谱条件：HP Hypersil ODS (4 mm125 mm)5m ，流动相 A：8.0 mmolL1 磷酸缓冲液(pH 7.2)，流动相 B：8.
10、0 mmolL1 磷酸缓冲液(pH7.2)+甲醇+乙腈(50+35+15)，流量 1.0 mlmin1，柱前自动衍生3程序：设置自动进样程序为依次吸取 1l OPA 试剂，5l 0.1 molL1，pH 10.4 硼酸缓冲液和 1 l 样品，梯度洗脱程序：0 min，0B；25 min，100 B；35 min，100 B；35 min，100 A；45min，100A。检测程序：荧光检测器波长 Ex=340 nm，Em =450 nm。1.7 统计学处理采用 SAS 统计软件，所有实验数据以 s 表示，不同组间比较采用方差分析，两样本间比较采用 Q 检验。检验水准 0.05。2 结果 脑缺血
11、 2 h 再灌注 24 h 后，与假手术组比较脑组织 GLU 显著升高(P0.01)，GABA 显著降低（P0.01） 。厚朴酚组与模型组比较 GABA 均显著性升高(P0.01)，大剂量厚朴酚组与模型组比较 GLU 显著性降低(P0.05)。结果见表 1。表 1 厚朴酚对脑缺血再灌注后脑组织 GLU 和 GABA 含量的影响 (略)3 讨论脑缺血后兴奋性氨基酸(EAA)过量释放，产生兴奋性毒性。GLU 是最主要的中枢兴奋性氨基酸递质，具有很强的神经毒性。GABA 是脑内主要的抑制性氨基酸递质，由 GLU 脱羧而成，其主要生理功能是与受体结合后使神经元产生突触前或突触后抑制。许多研究认为，再灌
12、注后兴奋性氨基酸大量释放，作用于突触后神经元产生兴奋性神经毒作用，导致突触后神经元损害6 。有研究发现在缺血早期 EAA 大量释放的同时，脑内 GABA 的释放也相应增加，在后期脑内 GABA 含量降低。缺血早期 GABA 大量释放，可能是由于在正常情况下神经递质水平受一个耗能的、内流外流循环转运系统所控制，缺血时由于能量衰竭转运系统受抑制，因此去极化导致的递质外流和重摄取抑制是 GABA 升高的主要原因7 。近年来大量研究表明 GABA 对脑缺血有保护作用，在脑缺血再灌注后 GABA 降低可能加重脑损伤18 。另有报道，GABA 及其拟似剂可以治疗脑缺血后因兴奋性氨基酸大量释放引起大的神经损
13、伤2 。采用生物鉴定法，在可逆性 MCAO 缺血模型上的研究发现，缺血 5 min 后腹腔注射 GABAB 激动剂 baclofen 20 mgkg具有神经保护作用9 。厚朴酚是传统中药厚朴的主要成分，现代药理学研究证明具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、拮抗钙调素、神经保护作用等多种药理作用。现已证明，以鼠胚脊髓运动神经元原代培养的实验模型，实验组分别加入单味中药提取物，用MTT 法观察其对细胞活力的影响。发现厚朴对脊髓运动神经元有保护作用。对周围神经损伤的修复可能有促进作用10 。也有研究表明厚朴酚能通过抗氧化作用降低脑缺血/再灌注神经元损伤3 。近来研究发现厚朴酚与和厚朴酚对GABAA 受体
14、具有选择性激动作用4 。本实验研究显示，脑缺血 2 h 再灌注 24 h 后脑组织 GLU 大量释放，而 GABA明显下降。厚朴酚预处理可以降低 GLU 释放，增加 GABA 水平，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。厚朴酚可以改善脑缺血再灌注损伤引起的 GLU 升高、GABA 降低而产生保护4作用，可能与下列中枢作用有关：作为 GABA 受体的激动剂与受体结合而发挥GABA 的作用；对谷氨酸脱羧酶有促进作用，增加 GABA 的合成和释放，抑制GABA 转氨酶，减少 GABA 的代谢最终增加脑内 GABA 水平，而对脑缺血产生抑制性保护作用。但是这些假说还有待进一步研究证实。参考文献：1Schwa
15、rtz-Bloom RD,Sah R.gamma- aminobutyric acid(A)-neuro-transmission and cerebral ischemiaJ. Neurochem, 2001，77(2):353.2Nelon RM,Hainsworth AH,Lambert DG, et al. Neuroprotective efficacy of AR-A008055,a clomethiazole analogue,in a global model of acute ischemia stroke and its effert on ischemia-induced
16、 glutamate and GABA efflux in vitroJ.Neuropharmacology,2001，41（2）：159.3Zhang Guang-Qin，Chen Shi-Zhong，Hao xue-Mei,et al.The protective of magnolol on cerebral ischemiaJ. Chinese pharmacological bulletin， 2003， 19(9): 1020. 4Ai,-J; Wang,-X; Nielsen,-M. Honokiol and magnolol selectively interact with GABAA receptor subtypes in vitroJ. Pharmacology，2001，63(1): 34.5L
