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1、根瘤菌的分离与鉴定,(1) 照相,(2) 挖掘和根瘤保存,根瘤选取:大个、新鲜、粉红色、尽量多取。 根瘤采集:1.主根上可以剥取少量根皮以保证根瘤完整。 2.侧根上的可带少许根。,采集,采集,农大豆2号,保豆3号,保存,每个单株植物的根瘤收集在一个卫生纸包中,每个采集点的多个植株放在一个装有硅胶的自封袋中。,分离及纯化,用无菌水浸泡干燥根瘤菌直至其复原。 2 .用95%的酒精浸泡35分钟,用5%的NaClO3 浸泡1分钟, 用无菌水清洗 57次(换水)。(在超净台上操作,并且在酒精灯附近,防止染菌),分离及纯化,(1) 根瘤浸泡,(2) 根瘤消毒,分离及纯化,3.用牙签(灭菌时尖头朝上,平头朝
2、下)的平头端在灭菌的玻璃平皿上将根瘤刺破(必要时可以滴加一滴无菌水)。用灭菌接种环蘸取菌液在YMA固体培养基上划线。用灭菌接种环蘸取同种菌液,在载玻片上进行革兰氏染色,镜检。,分离及纯化,消毒,刺破,划线,分离及纯化,4.待平板出现菌落后,观察,选取目的菌落再次划线纯化,镜检。,5.纯化后的菌划线在试管斜面培养基上,供保菌。,分离及纯化,挑菌,摇菌,稀释1万倍,稀释2万倍,稀释100万倍,保菌,使用YMA液体+20%甘油,吹打斜面上的菌,吸取保存。,使用YMA液体+20%甘油,吸取摇好的单个菌斑菌液。,提取基因组DNA,260/280:1.97 260/230:2.02 浓度:570ng/l,鉴定,16S rDNA序列测定:方法同书。 其中:dNTP:2.5mm 引物:10m 测序后,在NCBI blast 中进行比对, 一般情况下,相似性能达到99%左右。,