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1、1博莱霉素诱导大鼠肺纤维化过程中羟脯氨酸及氧化应激指标的变化作者：刘瑞，李成刚，梁欣，海春旭 【关键词】 肺纤维化 【Abstract】 AIM: To discuss the changes of hydroxyproline and the role of oxidationantioxidation disequilibrium in pulmonary fibrosis induced by bleomycin (BLM) in rats. METHODS: A single dose BLM was intratracheally injected to induce pulmona
2、ry fibrosis in rats, so as to observe the changes of tissue hydroxyproline and oxidativestress markers during the process. The animals were killed on the 3rd, 7th, 14th and 28th d separately. The pathological model was evaluated by HE and Masson dyeing method, and the hydroxyproline of lung tissue w
3、as determined. At the same time, malonaldehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity, reduced glutathione/oxidized glutathione (GSH/GSSG) ratio of lung tissue were also detected. RESULTS: From 7 d to 28 d, the hydroxyproline of lung tissue was increased in BLM groups compared with that
4、in control groups, especially on the 28th d (P0.05). On the 7 d and14 d, the tissue MDA were enhanced while the activity of SOD was decreased compared with those of control (P0.05). The GSH/GSSG ratio was lower than that of control on the 3 d and 7 d (P0.05). CONCLUSION: Tissue hydroxyproline can be
5、 a marker of BLMinduced pulmonary fibrosis. The oxidationantioxidation disequilibrium of cells and matrix may play a role in the pathological process. 【Keywords】 pulmonary fibrosis; hydroxyproline; oxidativestress 【摘要】 目的：观察博莱霉素诱导的肺纤维化模型中组织羟脯氨酸(Hyp)及各氧化应激指标的变化，探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的作用. 方法：二级 SD大鼠 40只，随机
6、分为模型组与对照组，每组 20只. 气管内注入博莱霉素 A5（BLMA5）溶液，建立肺纤维化模型. 分别于 3，7，14 和 28 d每组随机抽出 5只，处死后取肺脏行 HE, Masson染色鉴定模型并测定 Hyp含量. 同时分别以八木国夫荧光法测定肺组织脂质过氧化产物（MDA） ；改良盐酸羟胺法测定组织总超氧化物歧化酶（SOD）的酶活力；改良荧光法测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量；荧光法测定氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量. 并计算 GSH/GSSG值. 结果：成功建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型. 各指标在不同时间点出现变化. 模型组Hyp含量于 7 d时高于对照组，28 d达到最高（P0.
7、05）. 模型组 MDA含量随时间延长而增加，其中 14 d时显著高于对照组（P0.05） ，但在 28 d时有下降. SOD活力在 7 d, 14 d均降低，28 d时上升. 模型组 GSH/GSSG在 3 d, 7 d显著低于对照组（P0.05） ，14 d, 28 d又回升. 结论：Hyp 可作为博莱霉素诱导的肺纤维化的一个指标. 博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化伴有氧化损伤，且在不同阶段细胞内、外的氧化抗氧化出现失衡. 2【关键词】 肺纤维化；羟脯氨酸；氧化应激 0引言 肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病,目前的治疗方法尚不能改善其不良的预后，加强对肺纤维化机制的研究，并在此基础上
8、发展新的治疗策略已成为更加迫切的现实需要. 一般认为，在肺部，损伤组织及激发纤维化的主要病理机制在于炎症和免疫反应，但是大量研究表明，氧自由基在炎症和免疫介导的组织损伤中扮演了重要角色1. 故本研究通过建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型，观察各氧化指标在此过程中的变化，从自由基理论的角度，深入探讨氧化抗氧化失衡在该病发生发展中的重要作用. 1材料和方法 1.1材料 博莱霉素 A5，天津太河制药有限公司产品（批号：030305） ，8 mg/支. 丙二醛（MDA）标准品（Merk 公司）;2Thiobarbituric acid（Merk 公司）;磷钨酸（中国医药集团上海化学试剂公司）;盐酸羟胺（A
9、R, 天津化学试剂一厂）;氯化硝基四氮唑蓝，NBT，NEMI（华美公司）;Triton X100（上海试剂一厂）; 7210分光光度计(上海分析仪器厂虹桥分厂);970CRT 荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）;GL20A 全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表离心机厂）. 二级 SD大鼠 40只，雄性，体质量 180240 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 随机分为模型组与对照组，每组 20只. 1.2方法 1.2.1制备模型2以 10 g/L戊巴比妥钠（10 mg/kg, ip）麻醉大鼠，取仰卧固定位，常规消毒，行颈部正中切口，钝型分离暴露气管，于气管软骨环间隙穿刺注入 BLMA5生理盐水
10、溶液 0.20.3 mL（5 mg/kg） ，立即将动物直立并行旋转，缝合皮肤，待动物自然清醒后置笼内常规饲养. 对照组(假手术组)以等容量生理盐水(NS)注入气管代之. 1.2.2模型鉴定分别于气管内滴药后第 3，7，14 和 28日处理. 每批每组随机抽出 5只，麻醉处死. 剖开胸腔及颈部，分离气管和肺脏，结扎后取出肺脏，洗去血渍，去除结缔组织，吸干水分；从气管插管至左主支气管，结扎固定. 分离结扎右主支气管后离断，取右上叶置体积分数为 40 g/L甲醛中固定 1 wk，行 HE和 Masson染色3. 1.2.3肺脏羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量测定参考杨陟华等4
11、的方法，将肺组织样品剪碎，置于磨口试管中，用 6 mol/L HCl (WV14)水解(125) 3 h后，稀释至 10 mL，过滤. 取滤液 0.1 mL(空白管和标准管分别用蒸馏水和标准 Hyp代替)加蒸馏水到 1.0 mL，充分氧化，加入 0.5 mL柠檬酸缓冲液(0.25 mol/L，pH 6.0)和 1.0 mL氯胺 T溶液(0.05 mol/L)后 6 min，用过氯酸(3.15 mol/L，1.0 mL)终止反应(静置 5 min). 加入 100 g/L PDMAB 1.0 mL，于 80水浴中保温 10 min，显色完全后，自来水(25)冷却 5 min. 最后用 7210分
12、光光度计在 560 nm波长比色，测量其吸光度 A值，用下式计算 Hyp含量：肺组织 Hyp含量(mg/g)(0.5A 样/A 标)m. 其中，A 样为样品管吸光度，A标为标准管吸光度，m 为肺重. 1.2.4氧化损伤指标的测定剪取左肺，称质量，按 15 加入生理盐水制备匀浆. 3000 r/min离心 10 min，取上清，冻存备用. 分别以八木国夫荧光法5测定肺组织脂质过氧化产物（MDA） ；改良盐酸羟胺法6测定组织总 SOD的酶活力；改良荧光法7测定还原型谷胱甘肽（GSH） ；荧光法7测定氧化3型谷胱甘肽(GSSG). 并计算 GSH/GSSG值. 统计学处理：数据均以 xs表示. 采用
13、 SPSS 11.0统计软件包进行分析，采用成组 t检验，方差不齐时用 t检验. P0.05为有显著性差异.A: Control groupHE 100; B: BLM groupHE 100; C: Control groupMasson 100; D: BLM groupMasson 100. 2结果 2.1大体形态观察对照组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好. 模型组 3 d未见有明显改变，而 7 d见双肺有点状出血、灶状瘀斑. 14 d双肺色泽暗淡，局部见大小不等结节样改变，仍有陈旧出血点. 28 d 双肺呈灰白色，硬度增加，体积缩小. 表面有条索样凹沟. 2.2光镜观察对照组各观察点均
14、未出现明显病变. 模型组 3 d时出现炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变；7 d时肺泡间隔增厚，大量炎性细胞浸润，成纤维细胞开始增多；14 d 时肺泡炎仍较重，纤维组织进一步增加；28 d 炎症较前减轻，肺纤维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据(Fig 1). 2.3肺脏 Hyp含量（Fig 2）模型组 Hyp含量于 7 d时高于对照组，28 d达到最高（P0.05）. 2.4肺组织匀浆 MDA含量、SOD 活力、GSH/GSSG 比值变化（Tab 13）各指标在不同时间点出现变化. 模型组 MDA含量随时间延长而增加，其中 14 d时显著高于对照组（P0.05）
15、 ，但在 28 d时有下降. SOD活力在 7 d和 14 d均降低，28 d 时上升. 模型组 GSH/GSSG在 3 d和 7 d显著低于对照组（P0.05） ，14 d和 28 d又回升.表 1两组大鼠肺组织匀浆 MDA含量变化（略）表 2两组大鼠肺组织匀浆 SOD活力变化（略）表 3两组大鼠肺组织匀浆 GSH/GSSG比值变化（略）3 讨论 活性氧（ROS, Reactive oxygen species） 如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质，包括肺纤维化. 在正常的生理条件下，自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制. 然而，当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化抗
16、氧化系统失衡时，组织就会发生不可逆性损伤8. 博莱霉素与铁离子反应可以产生 ROS从而损伤蛋白、脂质和 DNA，其诱导的肺纤维化包括两个阶段. 早期的炎症阶段，大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润到间质或肺泡中9. 在随后发生的纤维化阶段，炎症细胞转移到肺部后，因被激活释放过量的氧自由基，除直接引起肺组织的脂质过氧化，启动 PF前的炎症反应，尚可能通过激活核因子 B(NFB)上调细胞因子的产量，间接促进纤维化的形成10 ；同时，肺纤维化的动物模型或患者中抗自由基的保护系统功能也有所降低. 据此，提出抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基系统的策略. 本实验应用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型，观察发现 7 d时肺泡炎明显，28 d形成纤维化，且模型组 28 d时羟脯氨酸含量显著高于对照组（P0.05）. 主要病变与指标都与文献一致，说明动物模型复制成功. Hyp是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的 13%,其他除弹性蛋白
