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1、细胞工程第一讲一、概述1、细胞工程（cell engineering）定义应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。2、细胞工程的研究内容细胞工程动植物细胞和组织培养细胞融合染色体工程胚胎工程细胞遗传工程器官培养组织培养细胞培养（快速繁育和产物大量制备）（改良性状，培育新品种）（培育新品种，单倍体和多倍体）（获得人们需要的成体）（无性繁殖，改变性状）克隆转基因技术（1）动植物细胞和组织培养植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应
2、器培养人参细胞生产有效药用成分。动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。（2）细胞融合改良性状，培育新品种（3）染色体工程主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦（4）胚胎工程主要是获得人们需要的成体如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿（5）细胞遗传工程克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。3、细胞工程的优势（1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细
3、胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。（2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展（1）萌芽阶段-理论渊源和早期的尝试（20 世纪初-30 年代中期）德国植物生理学家 Haberlandt 在 1902 年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。美国生物学家 Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907 年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，首创了体外组织培养法。（2）奠基阶段-离体培养技术的建立（ 20 世纪 30 年代中期-50年代中期）1934
4、 年美国植物生理学家 White 通过培养番茄根，建立活跃生长的无形繁殖系，并且在 28 年间转接培养 1600 代仍能生长。并正式提出植物细胞全能性学说。1940 年，Earle 建立无限传代的小鼠结缔组织 L 细胞系；1954 年，美国微生物学家索尔克利用原代培养的猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗并进入工业化生产。（3）蓬勃发展阶段-各种新物种的出现（20 世纪 50 年代末-至今）1958 年，利用胡萝卜髓细胞形成了体细胞胚，并发育成完整植株。1960 年，植物原生质体和体细胞杂交成功。在育种及次生代谢产物生产方面飞速发展，1958 年，冈田善雄灭活的仙台病毒诱导肿瘤细胞融合，开创了细胞融合的
5、崭新领域。三色鼠：绵山羊： 5、细胞工程的应用（1）粮食与蔬菜生产 利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。我国在这一领域已达到世界先进水平，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有 30 个左右。培育的新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。 （2）园林花卉 植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。如：世界兰花市场上有 150 多种产品，其中大部分都是用快速繁殖技术得到的试管苗。从此，市场供应摆脱了气候、地理和自然灾害等因素的限制。至今，已报道的花卉试管苗有 360 余种。已投入商业化生产的有几十种。我国对康乃馨、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫罗兰等品种的研究
6、较为成熟，有的也已商品化，并有大量产品销往港澳及东南亚地区。 （3）临床医学与药物 单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗，主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病，尤其适用于抵抗力差的儿童。 人类体外受精技术的日趋成熟，使人类对生育活动有了较大的选择余地，促进优生优育，提高人口素质，也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。 生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质，抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，通过培养、诱变等细胞工程或细胞融合途径，不仅大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可以同时抵御两种以上的病原菌的侵害。 （4）
7、繁育优良品种 目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产，使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，并且突破了动物交配的季节限制。另外，可以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，在体外受精，然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良新个体。综合利用各项技术，如胚胎分割技术、核移植细胞融合技术、显微操作技术等，在细胞水平改造卵细胞，有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。6、细胞工程产业化发展前景（1）新兴高技术产业（2）细胞工程产品的应用 人生长激素、促红细胞生成素、溶血栓药物、MAb（3）医学治疗 基因治疗、人造器官、干细胞治疗、体细胞治疗、抗癌免疫细胞治疗二
8、、体外培养细胞的分型1、悬浮型细胞（suspend cell）不需要贴附在支持物上，而是呈悬浮状态生长。细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长,能繁殖出大量细胞。观察细胞病变时不如贴壁细胞方便。2、贴壁型细胞（anchorage-dependent cell）细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长。贴壁型细胞又分为 4 种1）上皮型细胞（epithelium）：细胞呈扁平不规则多角形，中间有细胞核，彼此紧密连接。2）成纤维型细胞（fibroblast）：细胞贴壁后呈梭形或不规则三角形。3）游走型细胞（wandering）：细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或
9、变形运动，分散生长不连接成片。4）多形型细胞（polymorphic）：呈多角形，并伸出很长的神经纤维，很难确定其形状。三、动物细胞的特点1、动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易污染。3、培养过程需氧少，对机械搅拌或剪切力敏感。4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。5、原代细胞一般繁殖 50 代左右即退化死亡。四、动物细胞培养的定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。五、动物细胞培养的基本条件1、培养工具2、培养器皿细胞培
10、养板、培养瓶3、培养条件（1）温度：37偏离这一温度，细胞的正常代谢就会受到影响，甚至造成细胞的死亡。总的来说，细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强。温度不超过 39 度是，代谢强度与温度成正比；39-40 度历时 1 小时，会受到损伤，但仍可能恢复；41-42 度，会受到严重损伤；43 度以上时，细胞全部杀死。（2）pH：7.2-7.4 不同细胞对 pH 的要求不一样。但总起来说，原代细胞对 pH 的耐受差，而传代细胞和肿瘤细胞对 pH 变动的耐受强。低于 6.8 或高于 7.6都会对细胞产生不利的影响，严重时导致细胞蜕变或死亡。（3）气体：氧，二氧化碳氧气参与三酸酸循环，产生能量供给细胞生
11、长、增殖、及合成所需的细胞成分。但是不能过高或过低，过低时影响生长代谢，过高时产生细胞毒性。二氧化碳对于调节培养液的 pH 至关重要。碳酸氢钠调节 pH，NaHCO 3+H2O=Na+ HCO3-+H2O=Na+ + CO2 + H2O + OH-（4）渗透压4、细胞培养常用液体1）水: 配制各种培养液必需用纯水或新蒸馏的三蒸水。2）平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）: 平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营养。3） 消化液：胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞
12、分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。 4）pH 调整液：常用的有 HEPES 液和 NaHCO3 溶液。 5）常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液” 。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。通常使用青霉素终浓度 0.007-0.008g/100ml,链霉素终浓度 0.01g/100ml。一般配制成 100 倍浓缩液，可用 PBS 或培养基配制。 5、天然培养基（natural medium) 血清成分由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长
13、因子、激素、无机物等，这些物质能促进细胞生长增殖。血清种类胎牛血清（fetal calf serum）, 新生犊牛血清（newborn calf serum）, 小牛血清（calf serum）, 马血清（horse serum）,兔血清（rabbit serum）,羊血清（sheep serum）,人血清（human serum）血清的灭活血清经 56水浴 30min，以避免血清中的补体成分对细胞的毒性作用。血清的主要作用1）提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。2）提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松） 、类
14、固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。3）提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。4）提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。5）对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。6、合成培养基组成1. 氨基酸组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合
15、成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。2维生素维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。VA 是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD 参与调节钙的吸收。VE 是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK 缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。生
16、物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。3碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。4无机离子钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。7、合成培养基的种类天然培养基虽然营养丰富，能有效促进细胞在体外的生长增殖，但存在成分复杂、批次间差异大、易污染、制备过程繁琐等种种问题。合成培养基是根据细胞所需营养成分的基础上，用化学物质人工模拟合成的。TC199 DMEM RPMI1640 McCoy5A F12六、细胞培养的基本技术1、原代培养(primary culture) ：又叫初始培养，指由机体取得材料（细胞、组织或器官） ，培养到第一次传代前，即为原代培养。特点: 一般持续 1 一 4 周此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功
