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1、表达载体构建的一般原则 1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的基因本身必须置于正确的阅读框架之中。 用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。,2、启动子（关键因素） 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一。 因此，选择强的启动子及其相关的调控序列，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。,3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。 措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列,4
2、、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。 5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程中，一般采用UAA作为终止码。,6、外源蛋白的稳定性 可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解： （1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被选择性降解 （2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可以通过基因操作成为可分泌蛋白。 （3）使外源蛋白在宿主细
3、胞中以包涵体的形式表达,总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元件。,大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工程受体生物,第一节 大肠杆菌表达载体,大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,9,一、大肠杆菌表达载体的结构 原核表达载体：
4、适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求，然后增加表达元件。,10,1、表达元件(expression elements) 1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 噬菌体的PL启动子。 2）终止子：依赖于因子或不依赖于因子（遇茎环结构而终止）。 3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这一序列来启动翻译过程。,2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(
5、fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。,11,12,3、表达的控制 诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。 PL启动子受c基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物的抑制，在噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 c基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30)下阻抑转录，高温(40-45)下解除抑制。 T7噬菌
6、体启动子：较复杂,二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。,13,T7 表达系统 T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。 T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。,14,T7 表达系统转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒
7、系统,15,化学诱导型 噬菌体 DE3 是噬菌体的衍生株，一段含有 lacI启动子和T7 RNA 聚合酶基因的DNA 片段被插入其中。 用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。,T7 RNA 聚合酶基因,lac 启动子,E.Coli （DE3）,IPTG 诱导,温度诱导型 PL 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。,T7 RNA 聚合酶基因,PL 启动子,E.Coli （CE6）,热诱导,cI857,双质粒系统
8、一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带有 T7 启动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记不能相同，调控方式为控制 T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型,热诱导,18,T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。 解决办法 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录。,19,表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，
9、故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。,三、表达融合蛋白的表达载体,20,21,融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,22,技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3或5端，但必须维持正确的ORF。 选择合适酶切位点 加人工合成的DNA接头 构建位相载体,23,位相载体-含有3种读码框的系列载体,24,常用的融合表达
10、载体 1、GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：如Amersham公司(阿莫仙医药公司)的pGEX系列，其GST来自于血吸虫，融合蛋白下保持酶学活性，对谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。,谷胱甘肽,固定在琼脂糖树脂上,形成亲和层析柱,表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱,融合蛋白吸附在树脂上,其他细胞蛋白被洗脱出来,用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱,融合蛋白被释放出来,用凝血蛋白酶切割融合蛋白,获得纯化的目的蛋白,25,位相载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白直接纯化 产物，切割方便
11、： pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子,融合型载体-pGEX系列,2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签和Xa因子酶切位点，多聚组氨酸能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理可得到纯的目的蛋白。 将2价重金属阳离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。纯化的融合蛋白再用Xa因子处理可去除标签多肽，从而获得纯化的目的蛋白。,26,27,3、内含肽表达载体(即蛋白质内含子,是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列)：如NEB公司的Impact-Twin系统，将目的蛋
12、白放在两个可自裂解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。 4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。,28,分泌型融合表达载体-pEZZ18,Plac：Lac启动子 Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子 S：蛋白A的信号肽序列 两个合成的Z功能域（结合免疫球蛋白G，琼脂糖层析柱）,四、 表达产物的纯化 1、包涵体蛋白的纯化 通过机
13、械法、超声波处理等方法破碎外源蛋白的细胞 离心 获得包涵体 洗涤 去除包涵体结合的细胞蛋白 利用盐酸胍、尿素和SDS等溶解包涵体 蛋白质重新折叠,29,2、可溶性蛋白的纯化 融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白 分泌表达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产物。 可溶性的表达产物一般可展现应有的蛋白质活性。,30,不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。 如70%的抗生素来源于放线菌，如以寻找抗菌抗肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想，而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。,31,32,穿梭载体(shuttle vector)：能够在两类不同的宿主中复
14、制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至少有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。 通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。,第二节 穿梭载体,33,一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽孢杆菌的穿梭。 二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，如磷酸化、糖基化等。 三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的Ti质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。,第三节 整合载体,当外源基因整合到宿主细胞的染色体后，可以稳定地遗传，进而达到稳定表达的目的。 整合载体：将某个基因或某些基因插入到染色体中去
15、的载体。 根据整合方式的不同可分为定点整合和随机整合。 根据其作用可分为目的基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。,34,3.1 基因插入/基因敲除 同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体不仅含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。,35,3.2 随机插入突变载体 随机突变体库指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。,36,（1）、微生物插入突变载体 转座子是一类在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分,是基因组中一段特异的具有转位特性的独立的DNA序列。 以pEG922为例，其可用于革兰氏阳性细菌插入
16、突变体库的构建。 该载体上含有在革兰氏阳性细菌中复制和选择的复制区（该复制区是温度敏感型的，在42下不能复制）和氯霉素抗性基因。,37,插入突变体库的构建 将装载了一个四环素抗性基因的转座子Tn5401插入到载体pEG922中 将该载体转化到革兰氏阳性细菌 转座子发生一定频率的转座 在42下筛选仅有四环素抗性的菌落 得到的菌落就是发生转座的突变子（由于在高温下载体不能复制，随着细胞的分裂，载体就会丢失，只有发生转座事件的菌体才能表现出四环素抗性的表型。）,38,2、构建植物突变体库所用的载体 根瘤农杆菌介导的T-DNA插入或植物转座子标签是植物基因功能研究中常用的产生突变体的方法。 （1）T-DNA插入突变体 根瘤农杆菌介导的T-DNA插入到植物基因组时往往会导致插入位点的基因遭到破坏，从而可构建用于基因功能分析的突变体。,39,（2）植物Ac-Ds转座子双因子插入突变 这套系统利用玉米的Ac-Ds
