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1、 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 Our results show that silence of CAV-1 can inhibit the expression of MCP-1 induced by ox-LDL in endothelial cells. It suggests that CAV-1 may play an important role in the signaling pathway of ox-LDL-induced endothelial dysfunction. We will further
2、investigate that the role of CAV-1 in the LOX-1 mediated signal transduction by mutants construction, FRET and other technologies. Key words: Atherosclerosis Ox-LDL CAV-1 siRNA MCP-1 HUVEC 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 研 究 背 景 研 究 背 景 动脉粥样硬化(atherosclerosis ,AS)是多发性疾病, 其病理改变以动脉内脂
3、质沉 积, 粥样斑块形成及伴随的炎症反应为特征, 造成血管部分或完全堵塞进而导致 心、脑、肾等多器官缺血、梗死, 给人类健康造成极大的危害。 在AS 血管的管壁, 单核细胞黏附于血管壁并穿入内皮下形成泡沫细胞是动 脉粥样硬化的早期病变, 而平滑肌细胞增生、 迁移形成平滑肌源性泡沫细胞是该病 较晚期病变。这两种泡沫细胞的形成与单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoat tractant protein - 1 , MCP-1) 密切相关。 大量研究表明单核细胞的趋化主要由MCP-1 来实现, 多种物质及细胞因子都可以诱导MCP-1的表达, 而MCP-1 也可在多种细 胞尤其是构成动
4、脉粥样硬化病变的三种主要细胞单核细胞、内皮细胞和平滑 肌细胞中表达1。 大量的研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein , ox-LDL) 在 AS的病理过程中起着重要的作用2 ，如ox-LDL能够刺激内皮细胞多种炎性因 子和黏附分子的表达，诱导单核细胞黏附和迁移进入动脉内膜并转化为巨噬细胞； 加剧动脉粥样硬化的炎症反应等。Ox-LDL 的受体家族成员中有多种清道夫受体: 如A类清道夫受体、B 类清道夫受体、CD36、CD68 等。其中血凝素样氧化低密 度脂蛋白受体- 1 是Sawanura 等3 在1997 年新发现的存在于血管内皮细胞表面
5、 的ox-LDL 特异性受体,是血管内皮细胞摄取和代谢ox-LDL 的主要受体。 研究发现 血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1 , LOX-1)，在动脉粥样硬化的早期，血管内皮细胞表达LOX-1 比进展期 更活跃4，这与AS 早期血管内皮细胞大量表达MCP-1，从而促进单核细胞向内皮 细胞粘附、迁移的病理过程一致。有研究表明：当人冠状动脉内皮细胞与Ox-LDL 共同培养24小时后明显增加了MCP-1和LOX1 的表达以及单核细胞向内皮细胞 的黏附；但如果预先加入反义LOX1mRNA 则可抑
6、制上述过程5。这些研究结果 提示在AS 早期， LOX-1与ox-LDL 结合后,可能对激活内皮细胞并诱导内皮细胞分 泌MCP-1 起着重要的作用。 而有研究显示， LOX-1为型跨膜蛋白受体， 在静息状态下以单体形式存在6， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 结构分析显示LOX-1胞内段无SH2域，且不与G蛋白偶联7，但由LOX-1介导激活 的信号途径主要为酪氨酸蛋白激酶途径及G蛋白介导的PKC信号途径8 9，因此 LOX-1如何活化、 如何介导信号的跨膜转导、 进而激活哪些信号途径均有待进一步 研究。 细胞质膜小凹（cave
7、olae）是细胞膜上的一种特殊的囊泡状凹陷结构，其已知 的功能主要包括胞饮、胞吐、调节细胞内信号转导和维持细胞内胆固醇平衡四个 方面10 。CAV-1几乎存在于所有与AS形成有关的细胞类型中,包括内皮细胞,巨噬 细胞和平滑肌细胞,在AS形成中起着重要的作用。 我们已知小凹蛋白-1 （Caveolin-1， CAV-1） 通过它的脚手架区(Caveolin Scaffolding domain, CSD)来结合并影响信号分 子,受Caveolin-1调节的信号分子都有一个Caveolin 结合区域(Caveolin-binding domains, CBD) , CSD与所调节蛋白的CBD直接作
8、用抑制信号分子的活性。 Caveolin-1是信号分子的支架蛋白和负性调节蛋白。CAV-1的“脚手架”区域突变 分析:此区域有5 个关键的残基部位与它抑制信号分子的活性相关: Phe89 、 Phe92 、Thr93 、Trp98 、Phe99 。近年来研究表明: CAV-1主要和G2蛋白亚基 的无活性的GDP 合酶, CAV-1可抑制内皮一氧化氮合酶、腺嘌呤环化酶、Src 家族 激酶、Neu 激酶的活性,从而表明CAV-1是信号分子的“蓄水池”, CAV-1和“蓄水 池”中的信号分子相互作用,维持其无活性状态11。 由于CAV-1是信号转导中心,各种信号分子聚集在Caveolae 区，且本课
9、题组通 过激光共聚焦检测到LOX-1与CAV-1在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）上共定位，由 此我们推测，CAV-1可能协助LOX-1介导ox-LDL诱导内皮细胞MCP-1的表达增加。 那么，我们拟采用siRNA技术沉默CAV-1的方法，观察是否同样能够抑制MCP-1的 表达，从而推测CAV-1是否参与通过LOX-1介导ox - LDL 引起的内皮细胞分泌 MCP-1 ,将明确其作为预防及治疗靶点的可能性和可行性，并可根据其原理通过调 节LOX-1、CAV-1的相互作用而设计靶向性、特异性的防治药物，将能更及时、有 效地指导AS等血管损伤性疾病的一级预防和二级预防。 华 中 科 技 大 学 硕 士
10、 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 1 材料和方法 1 材料和方法 1.1 主要仪器 超净工作台 YJ-1450 江苏苏州净化设备公司 CO2 培养箱 Nuarie 德国 Western 电泳仪（DG-C 型） Hoefer, USA 转膜仪 BIO-RAD 北京市六一仪器厂 流式细胞仪 Pharmacia Biotech 酶标仪 Nuarie 德国 细胞培养瓶，滤器，眼科剪，镊子等 北京医疗仪器厂 倒置荧光显微镜 Olympus, 日本 -80C 低温冰箱 Nuarie 德国 高压蒸汽灭菌器 YXQ-SG41-280 上海医用仪器厂 紫外分光光度仪 U-28
11、00 Pharmacia Biotech 台式高速离心机 Sigma 低温高速离心机 Sigma 图像分析系统 mage pro-plus Kodak ,美国 凝胶电泳分析系统 Hoefer, USA 恒温水浴箱 武汉科学仪器厂 恒温振荡培养摇床 武汉科学仪器厂 Leica TCS2SP2激光共聚焦扫描显微镜 德国Leica公司 1.2 主要试剂 胰蛋白酶 Sigma 公司） -actin santa cruz 公司） DMEM 干粉培养基 Gibico 公司 OMEM 液体培养基 Gibico 公司 新生牛血清牛血清 Gibico 公司 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中
12、 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 HRP-羊抗兔二抗 Pierce 公司、 HRP兔抗鼠一抗 anta cruz 公司 ECL 显影试剂盒 Gibico 公司 蛋白质 Marker 晶美 小牛血清蛋白（BSA） Sigma 公司 PMSF Sigma 公司 甘氨酸（Glycine） Sigma 公司 丙烯酰胺 Sigma 公司 N, N-亚甲叉双丙烯酰胺 Sigma 公司 1.3 主要溶液与配制 （1）10PBS 储存液 80g NaCL，2g KCL，11.5g Na2HPO4，2g KH2PO4 以 500ml 三蒸水溶解后补水至 1000ml （2）01胰酶工作液 EDTA
13、0.02g， 胰酶 0.1g，PBS 100ml ，20冻存或 4储存 （3）DMEM 培养基配制 DMEM 培养基干粉一袋（1L） ，HEPES 3.0g， NaHCO32.0g 青霉素 80 万单位溶于 4ml 三蒸水中取 0.5ml 链霉素 100 万单位溶于 5ml 三蒸水中取 0.5ml 溶于新鲜高压灭菌三蒸水 1L，调 PH 值 7.2 （4）细胞裂解液（提取总蛋白） TrisCl（PH8.0） 10mmol/L Mgcl2.6H2O 1mmol/L EDTA 5mmol/L NP-40 1% PMSF 1mmol/L 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技
14、 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 脱氧胆酸钠 0.25% （5）Western 反应体系： 1） 2M /L TrisCl（PH 8.8）500ml： Tris 碱 121.14g，去离子水 450ml 加浓盐酸（约 30ml）调 PH 值至 8.8 后定容到 500ml，4一个月。 2） 1.0M /L TrisCl（PH6.8）500ml： Tris 碱 60.57g，去离子水 440ml 加浓盐酸（约 50ml）调 PH 值至 6.8 后定容到 500ml，4一个月。 3） 30丙烯酰胺（30AB 液）100ml 丙烯酰胺 29g 甲基丙烯酰胺 1g 去离子水，定容到 100ml，过
15、滤，棕色瓶保存数月。 4） 10SDS（PH 7.2）100ML 电泳级 SDS 10g 去离子水 90ml 加热至 68助溶，架几滴浓盐酸调 PH 至 7.2，定容至 100ml 5） 10过硫酸铵（AP） 0.1g AP 溶于 1ml 去离 子水中，分装，保存一周 6） 5Tris-甘氨酸电泳液 50ml Tris 碱 15.1g 甘氨酸 94g 10SDS 50mL 4保存，用时稀释成 1 工作液 7） 转移缓冲液 1000ml 甘氨酸 2.9g Tris 碱 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 去离子水，定容到 1000ml。 8） TBST 溶液 1000ml 3M NaCL 50ml ，Tween 20 1ml ， 1.0M Tris(PH 7.5) 50ml 去离子水，定容到 1000ml。 9） 5%封闭液 100ml 脱脂奶粉 5g TBST 100ml 10） 2SDS 加样缓冲液 10ml 1.0 M Tris-cl(PH 6.8) 1ML， DTT 0.309g， 10%SDS(PH 7.2) 4ML 溴酚蓝 0.02 g， 甘油 2ml 去离子水定容至 10ml 11） 制胶系统体系 7.5分离胶 5 浓缩胶 去离子水（去离子水（H
