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1、福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 1 前言 1 1 开展应答逆境转录因子基因启动子分离及表达分子机制研究的意义 植物在生长发育过程中总是不断地受到生物以及非生物逆境胁迫，在长期的 进化过程中植物也发展了一整套适应逆境复杂而有效的策略，包括植物对外界逆 境信号的感知、信号传递和相关防御反应基因的表达以及最终的生化、生理水平 上有利于提高植物适应逆境的调整，使植物抗性适量、适时和适地地表达，使物 质和能量得到充分而有效地利用以更好地繁衍。这种诱导表达机制对于人类进行 作物的有效遗传改良，特别对于基于基因工程的作物分子设计具有重要的指导意 义。然而，当前人们对这种机制的认识还相当有限。 转
2、录因子是植物感知逆境信号和信号传递过程中将细胞质内信号介导进入 细胞核、调控细胞核内相关基因表达的关键蛋白，它们具有诱导表达的特性。目 前已经发现了E R F 蛋白、W R K Y 蛋白、碱性亮氨酸拉链蛋白和M Y B 蛋白等， 在植物应答环境逆境的防御反应过程中起重要的调节作用。其中W R K Y 是植物 特有的转录因子，已经在水稻和拟南芥等植物中发现W R K Y 多基因家族成员， 在植物生长发育和防御反应中起十分重要的作用。以W R K Y 等诱导型表达转录 因子作为目标，分离它们启动子序列，分析其顺式作用元件的分布及对外界环境 逆境应答，不仅有利于该基因的功能及其表达调控机制，还可为人
3、类自觉应用这 些元件来构建对逆境能有效应答的诱导型合成启动子应用作物基因工程提供指 导。 1 2W R K Y 转录因子及启动子相关研究进展 1 2 1W R K Y 转录因子的结构与功能 1 2 1 1W R K Y 转录因子的结构和分类 W R K Y 转录因子是一类植物体中特有的转录调控因子，该家族的e D N A 最早 是从马铃薯m 】、野燕麦3 1 、欧芹【4 1 和拟南芥5 1 中克隆得到的。这些蛋白结构的一 个共同特征就是都含有一个高度保守的、含W R K Y G Q K 的D N A 结合域，称为 W R K Y 结构域。在植物中W R K Y 蛋白以多基因家族的形式存在，已经
4、完成全基 因组测序的W R K Y 当中拟南芥已经占有7 0 几个成员【6 】，而水稻有1 0 0 多个成员 【7 - 8 1 ，这些W R K Y 多基因家族的不同成员依据其结构可以分为3 大类：第1 类 4 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 W R K Y 转录因子含有2 个W R K Y 结构域，这类W R K Y 转录因子的D N A 结合功能主 要用C 端的W R K Y 结构域介导；第1 I 类W R K Y 转录因子只含有一个W R K Y 结构 域，其锌指结构为C 2 H 2 大多数的W R K Y 转录因子都是属于类，第I 类W R K Y 转 录因子也只含有1 个
5、W R K Y 结构域，但是其锌指结构为C 2 H C ，I I I 类W R K Y 转录因 子只存在于高等的植物当中，在一些比较低等的植物中尚未发现，而且该类 W R K Y 转录因子一般都是与植物应当逆境胁迫有关【9 】。W R K Y 蛋白的专一识别序 列是W b o x ，大多数W R K Y 基因自身上游的启动子调控序列里也含有W 元件【州O l 。 1 2 1 2W R K Y 转录因子在防御反应中的作用 植物在长期的进化过程中，为了抵御来自外界环境的伤害或者把伤害控制在 最低程度，不断进化逐渐形成了自身的两种防御系统。第一种防御系统是由病原 菌的侵染而形成的，即系统获得抗性(
6、s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，S A R ) 。另外一 种防御系统主要是通过各种信号分子激活植物体内相关的防御基因的表达，主要 的信号转导途径有水杨酸信号转导途径、脱落酸信号转导途径和茉莉酸信号转导 途径。W a n g 等【川研究表明B 1 1 W R K Y l 可能通过参与A B A 信号转导途径调控 B h G o l S l 基因的表达，从而导致了抗旱旋蒴苣苔叶片R F O ( r a f f i n o s ef a m i l y o l i g o s a c c h a r i d e s 糖半乳糖苷系列
7、寡糖) 的积累。但是目前关于W R K Y 蛋白在此 过程中所发挥的调控作用还没有更为深入和完整的证据。目前，一般认为，某些 W R K Y 转录因子的作用机制可能与防卫诱导的M A P K ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ) 级联反应有关，M A P K 是近年来被广泛研究的信号转导分子，它通过一系 列的磷酸化反应将外界信号逐渐放大并传递到细胞内，引起一系列生化和生理反 映【1 2 1 。 Z h a n g - 等t 1 3 1 对傩凇K y 2 4 基因的超表达分析，发现O S W R Y 2 4 基因
8、是一种新的 可以抑带I J G A 和A B A 信号传导途径的转录抑制因子。L i 等【1 4 】分别以W R K Y 7 0 超表 达和W R K Y 7 0 基因敲除的拟南芥突变体为研究材料，用真菌病原菌分别侵染两种 转基因拟南芥，结果表明，W R K Y 7 0 拟南芥超表达植株可以提高水杨酸介导烟草 白粉病毒的抗性，但是却会降低茉莉酸介导的白菜黑斑病毒抗性；相反，基因敲 除或下调W R K Y 7 0 的表达则降低植物对水杨酸介导的烟草白粉病毒抗性，这表明 W R K Y 7 0 可能是植物体中平衡水杨酸和茉莉酸防卫信号途径的一个重要决定因 子。 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕
9、业论文 1 2 1 3W R K Y 转录因子在植物生长发育中的调节作用 J o h n s o n 等【1 5 1 研究发现，W R K Y 转录因子参与了控制植物形态的变化，认为 拟南芥W R K Y 类转录因子T T G 2 基因至少可以控制三个不同的形态发生：毛状体 发育、外层种皮植物黏液的产生和内种皮中单宁酸组分的生成，还可能与根生长 发育有关。对拟南芥一幽，彤隧瑾因表达的研究表明，一些W R K Y 家族基因的 表达与植物叶片的衰老有关，如拟南芥中W R K Y 4 ，玩7 , 1 1 ，5 3 基因在叶片衰老早期 其表达量会显著增加，说明W K R Y 基因在叶片衰老过程中可能起
10、着调控作用【l6 1 ， S o n g I “ 1 对在P E G ，N a C I ，A B A 和N A A 作用下所诱导表达的水稻O s W R K Y 0 8 基因 进行了超表达转基因拟南芥研究，发现O S W R K Y 0 8 转基因拟南芥可通过增加侧根 的数量和初生根的长度来提高对盐胁迫的忍受力，半定量R T P C R 后发现3 5 S 启动 子下过表达的O S W R K Y 0 8 转基因拟南芥可以诱导两个应答A B A 非生物胁迫的拟 南芥基因A t C O R 4 7 和A t R D 2 1 ，这些结果表明O S W R K Y 0 8 基因可能是通过A B A 信
11、 号途径来提高转基因拟南芥对渗透压胁迫的抗性。 1 2 1 4W R K Y 转录因子在植物物质代谢中的调节作用 W R K Y 蛋白还参与调节植物的一些代谢过程。S u n l l 8 】等从大麦中分离得到一 个与糖信号应答因子( s u g a rr e s p o n s i v e ，S U R E ) 相结合的转录因子S U S I B A 2 ( s u g a r s i g n a l i n gi nb a r l e y ) ，S U S I B A 2 也是属于W R K Y 型转录因子，它不仅可以与调控异 淀粉酶基因表达的I S 0 1 启动子区域中的W b o x 结
12、合，还能与S U R E 元件结合，从 而促进基因的表达，进一步研究表明：S U S I B A 2 转录调节因子在淀粉合成中起着 重要的作用，由此可见，W R K Y 转录因子也可能参与了碳水化合物的合成代谢。 1 2 2 植物基因启动子的结构与分类 基因的功能与其表达是一致的，因此，往往可以通过基因表达特征的研究来 推测基因的功能。现代分子遗传学认为，基因表达主要受其启动子与相应的顺式 作用元件的互作调控。因此，基因的表达及其启动子的结构及其对基因表达的调 控是阐明特定基因结构和功能研究的主要内容。 1 2 2 1 植物基因启动子的结构 启动子是基因5 端上R N A 酶以及一些反式作用因
13、子的结合区域，是指R N A 聚合酶识别、结合和引导转录的一段D N A 序列。通过对很多基因的启动子区域 进行大量的分析发现，绝大多数功能蛋白基因的启动子都具有相似的结构模式， 6 福建农林大学2 0 1 0 届硕士毕业论文 大部分的植物基因启动子转录起始点为腺嘌呤A ，且两侧多为嘧啶碱基1 9 乏0 1 ，植 物基因启动子一般以其第一个A T G 作为转录起始位点。在2 5 b p 至3 0 b p 处含有 T A T A 序列，7 0 b p 至7 8 b p 处有C A A T 区出现，一8 0 b p 至一l10 b p N _ 含有G C 盒，通常 把T A T A 区上游的保守序
14、列称为基因上游的启动子元件，这些特征序列和结构可 以确保转录准确而有效地起始。 1 2 2 1 1T A T A 框 与其他生物一样，植物基因启动子区域中最具特征的序列就是T A T A 盒序 列，也就是R N A 聚合酶I I 的识别位点，同时也是一些反式作用元件因子与D N A 相互作用的位点之一，一般认为T A T A 盒参与并决定转录的方向。不同的基因的 T A T A 盒也不一定都一样，有些基因有两个以上的T A T A 盒有的基因甚至没有 T A T A 盒。近年来的很多研究表明，T A T A 盒没有方向性的。T A T A 盒的功能取决 于它所在的位置相对于转录起始位点的位置，
15、碱基置换甚至会导致启动子活性丧 失1 2 1 1 。总之，T A T A 盒是依赖于聚合酶I I 转录所必需的，它能够指导起始前复合 物的形成，决定转录起始位点并调控上游激活蛋白的行为。 1 2 2 1 2C A A T - b o x C A A T - b o x 以转录起始位点7 5 作为中心，一般在7 0 b p 至3 0 0 b p 之间，可以增 强转录的效率，其保守序列一般为G C ( C T ) C A A T C T 。C A A T - b o x 可以从正方两个 方向起作用，同时它与其他顺式作用元件之间有相互协作的关系。近年来在对 家兔B 珠蛋白基因C A A T 顺序的研
16、究中发现，用人工方法诱导C A A 删顷序发生 突变使家兔D 珠蛋白基因的转录水平降低。 植物启动子的顺式作用元件除了上述几种共有的保守序列外，启动子的一个 显著特点就是富含A T 。胛碱基对解链所需要的能量比较低一般也认为比较容 易解链，有利于转录的起始。植物基因启动子A 厂r 富含系列大多与基因转录的正 调控有关。但是经过进一步的研究发现，锕富含序列既可以作为正调控因子也 可以作为负调控因子。T j a d e n 等E 2 2 1 将豌豆G 融基因的启动子缺失一个3 3 b p l 拘A T 富含序列，发现可导致转基因烟草中的G U S 活性降低9 0 9 6 ，朋富含序列可作为 负调控因子的报道，则见于N i c o t i a n ap l u m b a g i n i f o l i a 中叶绿体a b 集合蛋白 ( C a b E ) 2 3 1 和植物凝集素P H A 三基因的启动子【2 4 1 。 不同来源的启动子还通常具有种属特异的调节序列。如单子叶植物S
