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1、质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,载体的功能及特征,载体的功能（P12）,为外源基因提供进入受体细胞的转移能力,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力,注意：上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,2.1.1质粒载体,2.1.1.1质粒的基本特征,定义：质粒是一类
2、存在于原核细菌和真菌细胞中，能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子。是处于生命与非生命的分界线上。,（1）质粒常见于原核细菌和真菌中；,（2）绝大多数的质粒是DNA型的，绝大多数的天然DNA质粒具有共价封闭、环状的分子结构，即cccDNA；,（3）质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb,质粒的基本特征,1.质粒的自主复制性：,质粒能摆脱寄主细胞的DNA复制系统的束缚进行自主复制；,质粒DNA上含有自己的复制起始区（ori），形成独立的复制子结构,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制,类型：,严紧型复制控制的质粒 1 - 5
3、拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 relaxed plasmid,质粒的基本特征,2.质粒的可转移性：,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个,细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；,非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在,和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。,质粒的基本特征,3.质粒的不相容性：,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个,细胞中，这种现象称为质粒的不相容
4、性，不相容性的质粒组成不,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：,质粒的基本特征,4.携带特殊的遗传标记：,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,2.1.1.2质粒的构建,原因：天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位
5、点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大,多是由少数几个野生型质粒构建而成的：,pSC101 8.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb，拷贝数 20 - 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,改造的原则,（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子质量 （2）灭活某些质粒的编码基因，应为非转移性质粒，应为松弛型质粒 （3）加入易于识别的选择标记基因 （4）引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点 （
6、5）根据外源基因克隆的不同要求，加装特殊的基因表达调控元件,构建过程（P14）,2.1.1.3质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker）,整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于
7、启动子等元件的克隆筛选,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC18 / 19：,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MC
8、S）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,2.1.1.4质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液
9、悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,加CsCl和溴乙锭；,超速离心过夜；,在紫外灯下吸取cccDNA；,稀释沉淀cccDNA。,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,加NaOH和SDS的混合溶液，破膜释放内含物；,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质；,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；,用无DNase的RNase去除残余的RNA。,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,沸水浴法：,用含有ED
10、TA和Triton X-100的,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,沸水浴40秒钟；,离心，用无菌牙签挑去沉淀物；,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。,缓冲液悬浮菌体；,另一类载体 噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主,细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在,一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的,有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。,2.1.3.1l 噬菌体的生物学特性：,生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的
11、温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61？个基因,2.1.2l双链噬菌体DNA载体,l 噬菌体生物学特性： 生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA,l 噬菌体生物学特性： 感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,l 噬菌体生物学特性： 感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围
12、为原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,D,A,l 噬菌体生物学特性： 溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶原状态,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于
13、体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,2.1.2.2l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50
14、%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,取代型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。 如Charon 4 载体：克隆能力大，2025kb,插入型 （Insertion vectors ） 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb,2.1.2.3 l-DNA载体的主要类型：,2.1.2.4 l-DNA及其重组分子的分离纯化：P22,将大肠杆菌在含有麦
15、芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达,外源基因,2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体,2.1.3.1M13噬菌体的生物学特性： 生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个VIII,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,III,VI,VII,XI,M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌合成“-”链 产生双链M
