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1、分子生物学常用技术,第十七章,分子生物学常用技术,凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片,第一节 凝胶电泳 (gel electrophoresis),电泳概念 基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度,电泳的用途 分离 鉴定纯度 测定分子量 凝胶电泳的种类 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis),分离核酸原理 操作要点 应用范围,（一）分离核酸原理,电荷效应 分子筛效应 分子构象,1. 电荷效应,核酸是两性电解质 pH
2、 = 3.5 , 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极,2.分子筛效应,小分子移动快 ，大分子移动慢,3. 分子构象,闭环超螺旋线状DNA开环DNA,+,-,（二）操作要点,支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收,1. 支持物,商品化的琼脂糖,琼脂糖种类,2. 凝胶浓度的选择,凝胶的制备,3. DNA marker,DNA marker,DNA 长度标准曲线,4. 电泳缓冲液,Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0,5. 样品制备,上样缓
3、冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青,点 样,6.电泳条件,潜水电泳 恒压电泳 低压: 12V/cm 中压: 810V/cm 高压电泳：几十V/cm 温度：1525,潜水电泳,7.电泳染色,溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法 加入凝胶液中 电泳结束后染色,EB染色原理,紫外灯下显色,8. DNA片段的回收,低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55kb),（三）应用范围,DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定,琼脂糖凝胶电泳,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(po
4、lyacrylamide gel electrophoresis, PAGE),分离原理 操作要点 优点 应用范围,（一）分离原理,电荷效应 分子筛效应,PAGE支持物,单体丙烯酰胺(Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED),聚丙烯酰胺凝胶,（二）操作要点,凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测 DNA片段的回收,1. 凝胶的分类,非变性凝胶：dsDNA 变性凝胶: ssDNA 尿素 甲酰胺 SDS,2. 凝胶浓度的选择,3. 凝胶液的配制,PAGE装置,电 泳,4. 凝胶中DNA的检测,溴乙锭染色
5、法 银盐染色法 甲醛 还原 放射自显影法,Ag+DNA,Ag（黑褐色）,5.DNA片段的回收,压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低,（三）PAGE优点,机械强度好、化学稳定性高 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高,（四）PAGE应用范围,分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析,第二节 分子杂交,分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术,一、分子杂交的基本原理,核酸的变性和复性,分 子 杂 交,DNA-DNA,DNA-RNA,杂交条件,靶分子 探针 杂交袋 杂交炉,杂交种类,被检核酸种类和方法 原位杂交 斑点杂交 Souther
6、n杂交 Northern杂交 Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交(),二、固相支持物,固相支持物的特性 结合能力强 不影响杂交反应 结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好,固相支持物的种类,硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane),1.硝酸纤维素滤膜,特点 吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足 不适于重复杂交 滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(200bp)结合能力弱,2. 尼龙膜,特点 结合能力强 可反复杂交 韧性强 适于电转移印迹法 对DNA小片段(10bp)结合能力强 不足 杂
7、交信号本底较高,分子生物学考试,时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) 地点 9教讲演厅 (150人) 9-2-1 (50人) 9-2-2 (50人) 9-3-1 (50人) 答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) 地点：逸夫楼3楼生化实验室,三、探针(probe),探针的概念 探针的类型 标记物的种类 标记方法,1. 探针的概念,特异结合和检测靶分子的活性物质 抗原抗体 配体受体 同源DNA/RNA,2. 探针的类型,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 蛋白质或多肽探针,3. 标记物的种类,放射性同位素(32P, 3H, 35S, 12
8、5I, 14C) 非放射性标记物 生物素 地高辛 荧光素 酶,4. 核酸探针的放射性标记方法,DNA缺口平移标记法 随机引物标记法 DNA的5末端标记,缺口翻译,特点 均一标记 制备dsDNA探针,随机引物标记法(random priming),随机引物 6nt 含有各种可能的排列顺序 特点 放射比活性缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针,DNA的5末端标记(5end labeling),碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针,DNA的5末端标记,四、Southern 杂交,Southern blotting/DNA blotting 1975
9、年，Edwen Southern等 印迹(blotting) : 转移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting,1. 印迹的方法,毛细管转移法 电转移法 真空转移法,毛细管转移法,电转移法,真空转移法,2. Southern 杂交的步骤,3. Southern 杂交的应用,基因的定性及定量分析 基因的酶切图谱分析 基因突变分析 RFLP,五、Northern 杂交,RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用 检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况,Northern
10、 杂交,六、Western 杂交,免疫印迹(immunoblotting) SDS-PAGE转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探针)检测 应用-蛋白质的定性定量分析,免疫印迹,Southern,Northern & Western,七、原位杂交 (in situ hybridization),定义 种类 细胞内原位杂交 组织切片原位杂交 基本程序 细胞/组织固定预杂交杂交冲洗 杂交信号检测 分析结果,组织切片,八、斑点杂交 (dot hybridization),第三节 PCR技术,聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) PCR的发展简史 PCR的基本原理
11、和步骤 PCR的影响因素 PCR的种类 PCR的应用,一、PCR的发展简史,1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想 1985年, Mullis 等发明了PCR技术 1988年, PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪,二、PCR的基本原理和步骤,基本原理DNA复制 三个步骤 变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension),PCR的原理,PCR的扩增产物,标准的PCR反应体系,10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq
12、DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul,三、PCR的影响因素,模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP Mg2+ 循环条件,模板,DNA RNAcDNA 对模板的纯度要求低,引物,长度：1530nt G+C含量：4060% 碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补 引物的3端 引物的5端 引物浓度：0.21umol/L,Taq DNA聚合酶,2.5U/100ul 20保存 最后加,底物,4种dNTP 的浓度相等 终浓度：200umol/L,Mg2+,浓度: 1.52.0mmol/L 过高: 非特异扩增 过低 : 反应产物减少,循环条件,变性温度和时间: 9096, 3060s
13、 退火温度和时间: 4060, 3060s Tm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间 7075 (72 ) 1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循环次数: 2535,四、PCR的种类,反转录PCR 原位PCR(in situ PCR) 实时PCR(real time PCR) 重组PCR(recombinant PCR) 锚定PCR(anchored PCR) 反向PCR(inverse PCR),原位PCR,原位杂交PCR 程序 固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原位杂交及检测,实时PCR的原理,五、PCR的应用,分子生物学研究 临床医学,分
14、子生物学研究,基因克隆 DNA序列测定 基因的体外定点突变 突变分析(PCR-SSCP) 基因定量,临床医学,病原体诊断 遗传病的基因诊断 肿瘤检测 法医学,第四节 DNA序列测定,Sanger 双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法(1977),Sanger 双脱氧链终止法,原理DNA复制 反应条件 模板 引物 dNTP（其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶,DNA的复制,2,3-双脱氧核苷酸(ddNTP),DNA测序操作,DNA自动测序,DNA自动测序仪,第六节 生物芯片(Biochip),20世纪90年代末 生物分子之间相互作用的特异性 种类 细胞芯
15、片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片,基因芯片,概念 种类 应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例,什么是基因芯片？,基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。,基因芯片,芯片的制备,基因芯片的种类,表达谱基因芯片 诊断芯片 检测芯片,基因芯片的应用领域,基因芯片,基因表达谱,疾病诊断,药物筛选,新基因寻找,测序,基因分型,基因突变,表达谱基因芯片及其检测原理,研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能,检测原理,表达谱基因芯片,应用举例,用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测 1999年，Gulop等 急性白血病的分型 AML(13/10) ALL(25/24),
