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1、第四章 蛋白质的稳定性和稳定化 第一节 蛋白质的稳定性 一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。 二、蛋白质稳定性的分子原因 1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结合作用。 金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。,2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物，从而显著增加蛋白质稳定性。 当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏
2、水区域，从而显著增加蛋白质稳定性,3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质稳定性无关。,4 二硫键 大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高其在溶液中的稳定性。 稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低,物质的熵是它所处状态的分子混乱度,物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对应比较有序的状态,熵值大的
3、状态对应比较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增大。,5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低。,6、氨基酸残基的坚实装配 蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。分子量为23万的蛋白质中约有个515水分子 。由布朗运
4、动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法。,7、疏水相互作用 带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白球体内部。从而蛋白质稳定性增加。,第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理,一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋
5、白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。,二、聚合 聚合分三步进行：N U A As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。,1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生天然
6、二硫键，则有可能使蛋白质再活化。,三、极端pH,图4-6 碱催化的-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨酸）。,硫代半胱氨酸残基,肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110）蛋白质可完全水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导致酶失活。,四、氧化作用 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+存在下），于碱性pH，半胱氨酸可氧化
7、成胱氨酸。氧化剂强度不同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸。 H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋氨酸氧化成它的亚砜。,五、表面活性剂和去污剂 表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的 去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导致蛋白质不可逆变性。 去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界面形成单层。,图4-7 去污剂分子的单体、单层和胶团形成示意图 表面活性剂分子的两亲性质使之在水溶液中能自发形成结构
8、有序的多分子聚集体,通常称为胶团,阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），与蛋白质的结合比例是溶液中游离SDS浓度的函数。当单体SDS浓度使某一生物结合位点饱和时，则以协同方式结合其它位点，导致蛋白质伸展。伸展使先前埋藏的疏水性氨基酸残基暴露，有利于SDS的进一步结合，直至达到饱合为止。对于几乎所有的蛋白质来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。SDS-多肽复合物本质上是胶团，SDS分子聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。 六、 变性剂 1、脲和盐酸胍 高浓度脲（8-10 mol/L）和盐酸胍（6 mol/L）常用于蛋白质变性，然而，尽管它们作用很有效，却没有普遍接受的作用机理
9、。,有两个特点已经明确， 第一，这些试剂消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作用的疏水相互作用。 第二，它们直接与蛋白质分子作用。尽管准确的作用机理不清楚，但脲及盐酸胍广泛用于检测蛋白质可逆伸展的构象稳定性。 应当特别注意的是，由脲可自发形成氰酸盐。8 mol/L脲溶液平衡时大约含有0.02 mol/L氰酸盐。氰酸盐可与蛋白质中的氨基和巯基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲溶液应在用前用优质固体脲新鲜配制,1 2、高浓度盐 高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要看盐的性质和浓度 . 与Hofmeister离子促变序列有关： （CH3）4N+ NH4+ K+ , Na+ Mg2+ C
10、a2+ Ba2+ SO42- CI- Br- NO3- CIO4- SCN-,1）越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强， 2）愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。 （NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用它。相反，NaSCN(硫氰酸钠)是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。,1 3、 螯合 1）结合金属离子的试剂,如EDTA能使金属酶失活，这是由于EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅因子造成的。这类失活常常是不可逆的，但失去金属辅因子也能引起大的构象变化，从而导致活力不可逆丧失。 2）螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质，因为螯合剂可稳定有害的金属离子。,E
11、DTA：乙二胺四乙酸,1 4、有机溶剂 酶既可在水溶液中发挥作用，也可在无水有机溶剂中发挥作用。 1）当与水混溶的有机溶剂加入蛋白质水溶液中时，则可看到酶失活。这是因为有机溶剂通过疏水相互作用直接结合于蛋白质，并改变溶液的介电常数。有机溶剂通过增加疏水核的溶解度，降低带电表面的溶解度而具有使蛋白质“从里往外翻”的倾向。 2）蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶失活。,七、重金属和巯基试剂 1、已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能
12、与组氨酸和色氨酸残基反应。银或汞能催化水解二硫键 2、巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是可逆的。 3、低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质巯基作用，形成混合二硫键，或者在两个半胱氨酸残基之间形成蛋白分子内的二硫键。双硫试剂与氧化型谷胱甘肽和含有催化作用必需的巯基的酶之间也会发生同样的二硫交换反应。,DTNB：5, 5-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）,八、热 热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。 有两种构象过程能引起不可逆热失活。 第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生蛋白质聚合。 第二，单分子构象扰动能引起
13、酶失活。 高温（90-100）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。 1、Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶失活。 2、系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的-氨基作用，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。,机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。从道理上说，变性是可逆的，但这很难验证，因为常伴随引起不可逆失活的聚合或共价反应。 1 振动 振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏水残基最大限度地暴露于空气。然后
14、，蛋白质由于疏水区域的暴露而聚合。 2 剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。,九、机械力,3、超声波 超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。 4、压力 0.1-6108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外两个失活机理： 第一，已经证明，多亚基酶在高压下可
15、解离成单体，取消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失活是不可逆的。 第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有关。,十、 冷冻和脱水 酶溶液通常可在低温下贮存时间较长时间，也有不少例外，冷冻可使蛋白质发生可逆和不可逆失活。 1、在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变。如磷酸盐缓冲液的pH在冷冻后可由7变到3.5，这个pH很容易引起蛋白质的酸变性。 2、盐的浓缩可提高离子强度，引起寡聚蛋白质的解离。,3、 二硫交换或巯基氧化。,随着冷冻进行，酶浓度增加，半胱氨酸浓度也增加。当这种浓
16、缩效应与构象变化同时发生时，分子内和分子间的二硫交换反应就很容易发生，巯基在低温下更易氧化，因为在-3部分冻结系统内的氧浓度要比0溶液中的高1150倍。这种浓缩效应还能增加氧自由基的浓度。,十一、辐射作用 1、不同的电离辐射（如-射线，X-射线，电子，-粒子）对蛋白质分子及其周围水分子产生的化学变化类型是相似的。 1）直接作用（辐射对蛋白质分子的影响）引起，电离辐射的直接作用由于形成自由基而引起一级结构的共价改变，继而交联或氨基酸破坏。 2）间接作用（水辐射分解副产物对蛋白质分子的影响）引起，是由于在水溶液中形成反应性产物，其中主要是OH(羟自由基) ，溶解的电子和H2O2等。,2、非电离辐射，如可见光或UV辐射也能使蛋白质失活。可见光的光化学氧化要求光敏化染料，它能吸收光能，然后氧化蛋白分子中的敏感基团（半胱氨基，色氨酸，组氨酸）。UV辐射能直接破坏蛋白质的氨基酸而使蛋白质失活；胱氨酸和色氨酸残基特别不稳定。,第三节 蛋白质的稳定化,酶稳定化方法概述,表4-4 酶稳定化方法概述,一、 固定化 1
