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1、维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）一、目的要求：（1）学习并掌握用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中维生素C含量的原理和方法。（2）了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。（3）熟悉微量滴定法的基本操作过程。二、实验原理：维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，它与体内其它还原剂共同维持细胞正常的氧化还原电势和有关酶系统的活性。维生素C能促进细胞间质的合成，如果人体缺乏维生素C时则会出现坏血病，因而维生素C又称为抗坏血酸。水果和蔬菜是人体抗坏血酸的主要来源。不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺
2、成效的重要指标。维生素C具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化维生素C氧化为脱氢型。2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）是一种染料，在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。抗坏血酸具有强还原性，能使2,6-二氯酚靛酚还原褪色，其反应如图：当用2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，滴下的2,6-二氯酚靛酚被还原成无色；当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的2,6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。因此用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色即为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。三、实验材料、主要仪器和试剂：1实验材料
3、：多种蔬果（西红柿、尖椒、绿豆芽等）2主要仪器：（1）天平（2）研钵（3）容量瓶（50mL）（4）刻度吸管（5mL，10mL）（5）锥形瓶（100mL）（6）微量滴定管（3mL）（7）漏斗（8）脱脂纱布（9）滤纸3试剂：（1）2 HCl（2）标准抗坏血酸溶液 精确称量抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）25mg，溶于25ml 4HCl中，移入50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用前配制，此溶液每ml 中含抗坏血酸0.5mg，。（3）0.01M 2,6二氯酚靛酚 准确称0.25g氧化型2,6二氯酚靛酚、0.21g碳酸氢钠溶于250ml热蒸馏水中，稀释至1000m
4、l，充分振摇，装入棕色瓶内，置冰箱内过夜，临用前过滤，用标准Vc标定其浓度。置冰箱内冷藏（4）保存不得超过3天（最长约可保存一周）。四、操作方法：一、标准液滴定取5ml标准抗坏血酸，用2,6二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微红持续15秒不退为终点，另取5 2HCl 作空白对照，滴定。计算2,6二氯酚靛酚溶液的浓度，以每ml 2,6二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的mg数来表示。二、提取1水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。每一样品称取10g或20g，放入研钵中，加入2HCl一起研磨成匀浆，提取液通过2层纱布过滤到50ml 容量瓶中，然后用2HCl冲洗研钵及纱布34次，最后用
5、2HCl稀释至刻度线。2如果提取液含有色素，则倒入锥形瓶内加入1匙白陶土（高岭土），充分振荡5分钟，滤纸过滤，白陶土吸附生物样品中的色素，有利于终点的观察。3取三角锥形瓶两个，各加脱色的提取液5或10ml，用2,6二氯酚靛酚溶液滴定，直至出现微红色30秒不退色为终点。记录两次滴定的ml 数，取平均值。滴定必须迅速不要超过2分钟，因为在实验条件下，一些非Vc的还原物质其还原作用较迟缓，快速滴定可以避免或减少它们的影响。4另取5或10ml 2HCl 作空白对照，滴定。5按下式计算每100g样品中所含的Vc的毫克数。维生素C含量（mg/100 g样品）（VAVB）CT100DW 式中：VA 滴定样品
6、提取液消耗染料平均值（mL） VB 滴定空白消耗燃料的平均值（ml）C 样品提取液定容体积（50mL） T 每mL染料所能氧化抗坏血酸的mg数 D 滴定时吸取样品提取液体积（5或10mL） W 被检测样品的重量（5或10g）【备注】(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物定容时泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇消泡。(2) 样品的提取液制备和滴定过程，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免抗坏血酸被破坏。(3) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释
7、度。(4) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。2% 盐酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用.(5) 干扰滴定因素有：若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。Fe2可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2不会很快与染料起作用。样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。(6) 提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。（7）
8、市售2,6-二氯酚靛酚质量不一，以标定0.4mg抗坏血酸消耗2mL左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。五、思考题1该法测定抗坏血酸有何不足？2用2%盐酸提取样品的目的是什么？参考答案1用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，可以一次测定大量的样品。但有下述缺点：第一，在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在，本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，可预先用白陶土脱色，或加入23ml二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点。第三，生物组织提取物和生物体液中常有其他还原性的物质，其中有些也可以在同样条件下使2,6二氯酚靛酚还原脱色。2用2盐酸制备样品提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸为氧化型而无法滴定。如果样品中有较多亚铁离子（Fe2）时，亦会使染料还原而影响测定，这时应改为8乙酸制备样品提取液。结果分析：( mg/100g )西红柿：14.96，15.84，10.12；青椒：50.08，66.88，77.10，75.00；苹果：0.743，大蒜：6.16，8.8，10.12；西瓜肉：8.36；大葱：12-13；土豆：2-13；豆角：18.48；茄瓤：7.48；桃：4.84；豆芽：10；
