《实验二-培养细胞的观察和检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验二-培养细胞的观察和检测方法（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二 培养细胞的观察和检测方法一、 细胞计数法 细胞计数法（cell counting）是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用细胞计数板(即血细胞计数板)进行。既可用于分散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。（一）制备细胞悬液 原代培养前用机械或化学方法分散组织成为单个细胞悬液。对于悬浮培养的细胞，可直接进行下面的步骤进行计数。如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。步骤如下：1) 终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。2) 给培养瓶内加入1m1 0.25胰蛋白
2、酶溶液，于37消化35 min，期间不断在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。3) 加人一定量的培养液(如果这些培养细胞不再有用，可加PBS)，用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。(二) 计数与计算过程1) 在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。2) 用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片下被液体充满为止。3) 置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按实际或估计细胞计数。4) 按下式计算细胞悬液的密度：细胞密度(4大格细胞总数4)x 10000(个ml)二、活细胞的染料排除检测法由于死细胞的细胞膜通透
3、性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞，可进一步分别计数。（一） 台盼蓝排除检测法1. 2台盼蓝溶液的配制：称取2g台盼蓝(trypan blue)，加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至50m1，离心后取上清液，再加入1.8NaCl溶液至100 m1，即成工作液。2. 活体染色与细胞计数：l 将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。l 2 min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，
4、呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。（二） 溴比乙锭和碘化丙锭排除检测法溴比乙锭（ethidiumbromide，EB）和碘化丙锭（propidium iodine，PI）均为荧光染料，可与DNA特异性结合。1. 染液配制：取EB或P1 5 mg，枸橼酸钠0.1g，NP-40 0.3 ml，共溶于100ml蒸馏水中。避光保存。2. 荧光染色与计数：取细胞悬液和EB或PI染液各0.5ml，混匀。静置10-30min后于荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细胞。也可用流式细胞仪测定，激发光波长为488 nm。2h内荧光保持稳定。三、细胞活力测定的MTT比色法此法的原理是活细胞的线粒体脱氢酶能将染料
5、MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲瓉（formazan）颗粒，后者被二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）或酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用OD值表示）反映出生活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。1. MTT溶液的配制：将5 mg MTT溶于1 m1培养液(与所培养细胞用液相同，不含酚红)、0.01 molL PBS （pH 7.2）或生理盐水中。用0.2 m滤膜过滤。于4避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。2. 实验过程：1) 将细胞培养于96孔培养板。实验时每孔含180 l培养液。2) 加入20 l MTT液，继续培养34h。3) 吸去培养
6、液，加入200 l含0.040.1 molL盐酸的异丙醇溶液二甲基亚砜（DMSO）。在微型振荡器振荡5 min。4) 在酶标仪上测定光吸收。测定波长为490或570 nm。四、普通染色观察苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000 rpm，10 min)，弃上清
7、液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。（一）HE染色1. 染液配制：1) 苏木精染液：称取0.5 g 苏木精，5.0 g钾矾，0.1 g碘酸钠加温溶于70 ml蒸馏水。再加入30 m1甘油，2 ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液, 可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。2) 伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5 g伊红溶于100 ml 70乙醇或蒸馏水即成工作液。2. 染色程序:1) 用10甲醛(福尔马林)固定培养物30 mim，或以丙酮固定15 mim。2) 蒸馏水洗1次后，入苏木精染液510 min染细胞核。3) 入0.5盐
8、酸70乙醇溶液1 min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。4) 入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱碱性)长时间浸泡。也可1NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。5) 蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。6) 入伊红染液30s1 min。7) 用梯度乙醇溶液脱水：70、90、95乙醇各30 s1 min；100(2次)各2 min。如伊红为乙醇溶液，则略去70%乙醇。8) 用二甲苯透明2次，各5 min。9) 树胶封固。3. 染色结果：细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞
9、)则亦呈蓝色。（二）吉姆萨 (Giemsa) 染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。1. 吉姆萨染液的配制：1) 取1.5g吉姆萨粉末放入50 ml甘油，置于60温箱，约3h后溶解。2) 取出后倒人50 ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。3) 将母液与0.1mol/L PBS(pH6.9-7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。2染色程序：1) 将标
10、本用甲醇固定510 min。2) 入吉姆萨液染色1015 min。可用染色缸，或将染液滴覆于标本。3) 蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。3染色结果：细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。五、免疫细胞化学1. 培养的细胞用0.1 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.27.4）洗15 min（5 min 3次）；2. 用4多聚甲醛固定液固定20 min，晾干；3. 3%H2O2孵育20 min灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗，0.1 mol/L的PBS缓冲液浸泡10 min；4. 滴加山羊血清封闭液，室温20 min，吸去多余液体，不洗；5. 滴加第一抗体，4过夜后用PBS缓冲液洗5 min 3次；6. 滴加连接过氧化物酶的第二抗体，37孵育30 min，PBS缓冲液洗5 min 3次；7. DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至细胞，室温显色，镜下观察控制反应时间，一般510 min，显色完毕，蒸馏水冲洗以终止显色。8. 观察、拍照。
