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1、培养基灭菌与空气净化,第一节 培养基灭菌 一、灭菌的原理和方法,消毒(disinfection)与灭菌(sterilization) 的区别?,用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 例如,巴氏消毒法,是将物料加热至60维持30min,以杀死不耐高温的微生物营养细胞。,消毒,用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。灭菌条件:121,20-30min。 消毒不一定能达到灭菌要求,而灭菌则可达到消毒的目的。,灭菌,关于灭菌和消毒的不正确的理解是( ) A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细 胞、芽孢和孢子 B消
2、毒和灭菌实质上是相同的 C接种环用灼烧法灭菌 D常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外 线法、化学药品法,防腐(antisepsis),利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖,从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 (1)低温 (4)高渗 (2)缺氧 (5)高酸度 (3)干燥 (6)防腐剂,除菌的方法,培养基的加热灭菌 空气的过滤除菌 紫外线或电离辐射 化学药物灭菌,1.化学试剂灭菌法,甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围:环境、皮肤及器械的表面消毒,2.射线灭菌法,3.干热灭菌法,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围:无菌室、接种箱,常用烘箱,灭菌条件:160下保温1h 适用范围:金属
3、或玻璃器皿,4.湿热灭菌法,利用饱和蒸汽灭菌,条件:121,30min 适用范围:生产设备及培养基灭菌,5.过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物 适用范围:制备无菌空气,6.火焰灭菌法,火焰 适用范围:接种针、玻璃棒、三角瓶口,谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是( ) A高压蒸汽灭菌 B高温灭菌 C加入抗生素灭菌 D酒精灭菌,培养基的湿热灭菌,蒸汽具有很强的穿透能力,而且在冷凝时会放出大量的冷凝热,很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程,也称实罐灭菌。,(一)间歇灭菌 (常用),240,160,12
4、0,80,时间(min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,过程包括: 升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献: 20%、75%、5%。,发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,(二)连续灭菌(又称连消),将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行 加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的基本设备有哪些 ?,问题,连续灭菌的流程与设备,(1)配料预热罐,将配制好的料液预热到6070 C ,以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声; (2)连消塔,用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度(12
5、6132C );,(3)维持罐,使料液在灭菌温度下保持10min。因为:连消塔加热的时间很短,光靠这段时间的灭菌是不够的; (4)冷却管,使料液冷却到4050C后(冷水喷淋) ,输送到预先灭菌过的罐内。,连续灭菌过程中温度的变化(虚线),间歇灭菌与连续灭菌的比较,空气净化(除菌) 发酵对空气无菌程度的要求 一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过,即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3。,空气除菌,空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 米。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。灰尘粒子的平均大小约0.6m左右,空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m)。,104,空气
6、除菌的方法,过滤除菌 热杀菌 试剂灭菌 辐射灭菌,无菌室、培养室、仓库,空气过滤除菌的原理与介质 过滤除菌的种类 绝对过滤:过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 如聚乙烯醇缩甲醛树脂(PVF)制成的 0.3 m的微孔滤膜。 深层介质过滤:介质的孔隙一般大于微生物细胞。 如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。,深层介质过滤的原理 1、惯性冲击作用: 2、拦截滞留作用: 3、布朗扩散:1um 慢气流 不规则 直线运动 4、重力沉降:重力 气流拖带力 5、静电引力作用,深层介质过滤的原理 微粒随气流通过滤层时,由于滤层纤维的层层阻碍,使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动,引起微粒与滤层纤维间
7、产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上,实现过滤的目的。,空气过滤除菌介质,()纤维状或颗粒状过滤介质 棉花:有弹性,纤维长度适中(常用) 玻璃纤维:直径小,不易折断,过滤效果好。 活性炭:要求质地坚硬,颗粒均匀。 缺点:体积大,装填费时费力,松紧度不易掌握,空气压降大。,()纸类过滤介质 超细玻璃纤维纸:36张叠在一起使用,过滤效率高,压降小。 缺点:强度不大(特别是受潮后)。,发酵生产中制备无菌空气的 大致过程,空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 空气预处理 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气过滤,空气过滤除菌流程,高空取气,为远离地面几十米的管
8、子。 每升高10米,空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,粗过滤器 作用:捕集较大的灰尘颗粒,并保护空压机 要求:过滤效率高、阻力小。,前两步目的:提高压缩前空气的洁净度。,空气压缩 克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。,空气贮罐 紧接空压机安装 消除压缩机排出空气量的脉冲,维持稳定的空气压力。 利用重力沉降作用除去部分油雾。,压缩空气的冷却 压缩后空气温度显著上升,能引起过滤介质的炭化或燃烧,增大发酵罐的降温负荷,增加培养液水分的蒸发,需冷却。,压缩空气的除油除水 冷却降温后的空气湿度增大,会使过滤介质受潮失效。,旋风分离器利用离心力进行沉降,对于1
9、0m以上的微粒分离效率较高。 丝网分离器利用惯性进行拦截,分离效率较高,能除去25m的细小颗粒。,旋风分离器,采用惯性拦截等机理,有效去除空气中的水、油雾、尘埃,不锈钢丝网可清洗,使用寿命长。,空气的加热 将除油水的空气加热(温差在1015C 左右),降低相对湿度(达50%60%)后,输入过滤器。,发酵生产中制备无菌空气的 大致过程,空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 空气预处理 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气过滤,为什么要进行空气的预处理? 提高压缩前空气的洁净度 去除压缩后空气中的油和水,空气过滤器 过滤除菌的关键设备,发酵车间的空气过滤器,空气净化的流程,吸气口吸入的空气先经过
10、压缩前的过滤 进入空气压缩机(120150C) 冷却(2025C),除去油、水,再加热至30 35C。 最后通过总过滤器和分过滤器,获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,发酵设备发酵罐,发酵罐的特点 轴封严密,泄漏少 能承受一定压力、温度 搅拌通风装置保证气液充分混合 具有足够的冷却面积 死角少,灭菌彻底 适宜的径高比(高与直径的比值为2.54),发酵罐的类型,搅拌釜反应器 鼓泡式反应器 气升式反应器,鼓泡式反应器 气升式反应器,发 酵 控 制 Fermentation control,实验一 产酶菌株的筛选,定方案:首先要查阅资料,了解所需
11、菌种的生长培养特性。 采样:有针对性地采集样品。 增殖:人为地通过控制养分或培条件,使所需菌种增殖培养后,在数量上占优势。 分离:利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定:进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,新种分离与筛选的步骤,(一)采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中,以细菌和放线菌为主,富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。,从自然界筛选,2、采样季节:以温度适中,
12、雨量不多的秋初为好。 3、采土方式:在选好适当地点后,用小萨子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。,(二)增殖培养,为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生物至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择性培养基,选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉、纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源,那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长,而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,(三)培养分离,尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离,纯化。在这步,增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用,而且控制得细一点,好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,(四)筛 选,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适合于工业生产用菌种。,(五)毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的,将其作为生产菌种应当十分当心,尤其与食品工业有关的菌种,更应慎重。据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验。,