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1、兼顾速度与可靠性 Eppendorf PCR系统,20 Years of PCR,Kary Mullis,PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow,Denaturation 94C,Annealing 55C,Elongation 72C,Pol,Pol,PCR,5,3,5,3,Separation of strands,Annealing of primer,Elongat
2、ion by polymerase,PCR后分析结果,PCR products in different sizes,3kb 500bp 300bp,为什么终点法定量不准确?,同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。,典型的PCR四阶段,半对数图谱,线性图谱,平台期,典型的PCR四阶段,线性增长期,基线期,指数增长期,PCR理论方程,lg DNA,循环数,线性期,平台期,y = x(1+e)n,指数期,N = N0 x (1+e)n,N: 产物分子数 N0: 起始分子数 e： 扩增效率 n: 循环次数,PCR理论方程只在指数期成立,PCR指数增长期的规律,PCR扩增为指数
3、扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn= X(1+E)n 0E1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，X为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.,定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期; 而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期,为什么终点法定量不准确?,同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。,Ct (Threshold Cycle)-The cycle number where the
4、reaction fluorescence exceeds background fluorescence.,Cycle #,Fluorescence,Threshold,Threshold-The peak of background fluorescence, as defined by the platform or the user.,Amplification Plot,定量分析原理,Yct= X(1+E)n =2n X Ect=1,CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 CT值与起始模板浓度成负相关关系, 不同CT值的模板起始浓度
5、相差2n倍, n为CT间差值,为什么CT值起始DNA浓度?,当循环次数n=CT值时：,RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) lg Rs,即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）,Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs,定量PCR的实质,模板定量 找到PCR的指数增长期 定量数据归一化,real-time PCR应用范围,科研的主要工具 mRNA与基因表达的研究 DNA拷贝数的检测 单核苷酸多态
6、性（SNPs）的测定 DNA 芯片结果认证 医学方面应用前景更是令人鼓舞 极微量的基因表达定量 病原体检测,绝对定量,通常用标准品作为外参照制作标准曲线. 注意保持与目的基因的同源性,标准曲线的制作,什么是阈值,基线,阈 值,标准偏差,基线信号的标准偏差 x 10,基线阈值CT值,20- 19- 18- 17- 16- 15-,CT, A, B, C,CT 16 18 19,Absolute amount 50,000 copies 12,500 copies 6,250 copies,Sample A Sample B Sample C,标准曲线方法,通过CT值测定起始DNA量,浓度增加1倍
7、，CT值减小1个单位 浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位,相对定量,Sample,Non treated sample,2- Ct = Change in Expression Level,Gene of Interest,相对定量,D Ct = 9.70,D Ct = -1.7,D Ct = target - ref,D Ct = target - ref,Difference = DCt-DCt = DDCt = 9.70-(-1.7) = 11.40,-2- Ct = - 2 (Ctarget- Ccalibrator) - (Ctarget- Ccalibrator),DNA 芯片
8、结果复证,DNA甲基化检测,Before Bisulfite Treatment: Wild-Type DNA 5.GCGGACCGCG After Bisulfite Treatment: Unmethylated DNA 5.GUGGAUUGUG Methylated DNA 5.GCGGAUCGCG,高通量 SNP 筛查,Amplifluor Primer (UniPrimer),Quencher,PCR,SNP,Real Time PCR 技术的诞生,1992年，Higuchi R等第一个报导了实时定量PCR技术 Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic
9、PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.,所谓 实时定量PCR技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监控整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.,实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合,Fluorescent Dyes 荧光分子或荧光染料,Exitation peak,Emission peak,Reaction,Amplification Plot,Time (Cyc
10、le #),Fluorescence,荧光信号累积与扩增曲线,荧光分子或染料的检测方法,荧光分子内参式检测（DNA Specific Dyes） SYBR Green I 荧光标记的特异探针 水解探针: Taqman 杂交探针: FRET （Dual Probes） 分子信标: Molecular Beacons 荧光标记引物: Scorpion 和 Amplifuor 其它类: BD QZyme,DNA specific Dyes e.g. SYBR Green I,SYBR Green I 的检测原理,熔解曲线分析引物二聚体,Primer dimers,Product of Interes
11、t,UNG预防污染,UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。 它在50C激活，95C灭活.用于预防非特异性PCR扩增和污染。,在定量PCR开始前增加50C的保温步骤， UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染,仪器热启动,Innovative technical feature for device-supported HotStart PCR Perfect combination: Mastercycler ep S and HotMaster Enhances the PCR to nearly the maximum,脉冲 PCR = 超快的升温速度 +
12、极大缩短初始升温所需时间,6C/sec,8C/sec,TaqMan探针法的核心: 利用Taq酶的53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号 FRET 荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer,TaqMan 探针原理,Reporter,Quencher,Real-Time QPCR常用染料,TaqMan 探针原理,多探针的反应体系,Two or more Probes and Dyes in one Tube,Target 1,Target 2,微卫星系统,Mastercycler ep-新一代PCR仪的代表,超快的升/降温速度,脉冲 PCR
13、,独立直观的控制面板,ESP 电子样品保护热盖,Mastercycler ep系列-多种模块选择,铝块,铝块,银块,Eppendorf在定量PCR领域厚积薄发,Mastercycler ep realplex实时定量PCR仪的开发秉承了Eppendorf既往的经验. 是将经验融入最新技术的精品之作 回顾Eppendorf 60年的发展历史，当之无愧为高品质实验室仪器的供应商。 Eppendorf拥有55年生产光学仪器的经验， 近10年来，热循环仪已成为 Eppendorf产品家族中的重要组成。 。,real-time PCR 仪器构造,Exitation light source,Filter
14、,Detector,热循环仪,光学元件,软件分析,Mastercycler ep realplex,A 4-colour detection unit in a space saving design,Thermal Module,Sliding Optics Module,Mastercycler ep升级为定量PCR仪,ep Gradient/S,两通道ep RealPlex2,四通道ep RealPlex4,六通道ep RealPlex6,COMING SOON!,在Mastercycler ep梯度PCR的基础上，整合一个可靠而高度灵敏的光学检测系统，就构成了最新的Mastercycl
15、er ep realplex实时荧光定量PCR系统。,Mastercycler ep realplex -模块化设计,A. Mastercycler ep realplex2 96 LED Array excitation at 470 nm 1 channel photomultiplier (CPM) 2 detection wavelenghts: 520 nm and 550 nm,B. Mastercycler ep realplex4 96 LED Array excitation at 470 nm 2 channel photomultipliers (CPM) 4 detec
16、tion wavelengths: 520 nm, 550 nm, 580 nm, 605 nm,Two Thermo modules Aluminum block (ep gradient): 4C/s heating, 3C/s cooling Silver block (ep gradient S): 6C/s heating, 4.5C/s cooling, impulse PCR,Mastercycler ep realplex2：光路特征,96 LED Array,CPM Detector,每个CPM上带两个滤光片,96孔激发模式,由96个LED（光电二级管）组成的光阵列，依一种一一对应的关系将
