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1、基因有限公司市场部 黄国庆,定量PCR反应体系优化及实验实例分析,荧光定量PCR的定量方法,通用型的荧光染料检测法 SYBR Green I法 利用荧光染料（如SYBR Green I）与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，缺点是专一性不如探针法 。 特异性的荧光探针法 Taqman探针法 利用荧光标记的特异性探针和引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于序列专一扩增检测，不过增加了荧光探针的成本。,定量PCR实验基本流程,准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA) PCR反
2、应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix) 样品编辑(样品名、样品类型) 设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线) 运行PCR，自动分析数据,模板的制备,RNA样品 real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。组织或细胞总RNA抽提，以mRNA为模板反转录得到cDNA；以cDNA为模板进行定量PCR. DNA样品 组织或细胞的DNA抽提,总RNA的质量评价方法,1.检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD2
3、80（Ratio，R）。R在1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 2.RNA的电泳图谱 电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。,总RNA的质量评价方法（续）,3.保温试验 方法很简
4、单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。,RNA质量判定标准,引物的设计原则,上下游引物要保守 为了能够扩增出所需
5、要的保守片段，必须对保守的100-200bp片段进行PCR扩增。 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2。 确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。 跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。,探针的设计原则,1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。 2. Taqman探针的长度最好在
6、25-32bp之间，且Tm值在68-72之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 避免探针中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基 5. 探针的5端不能为G，因为G碱基可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5端离上游引物的3有一个碱基。 7. 避免探针与引物之间形成二级结构。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。,
7、SYBR I染料法实验优化方案,Tips：提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度要比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应要高出 0.5 到3mM。,Taqman探针法实验优化方案,Tips：2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为cDNA(1-100 ngRNA反转录所得cDNA) 模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。,引物二聚体的解决（一）,1.引物的设计问题 如何判断问题产生于引物的设计？ 常规PCR实验中能否通过调节退火温度消除
8、引物二聚体 常规PCR是否同样存在大量引物二聚体 如果常规PCR实验无法消除二聚体，则说明二聚体是由引物设计造成的，需从新设计引物 退火温度的问题 如果以2为温度梯度，提高退火温度，寻找最佳的退火温度,引物二聚体的解决（续）,3. 其它因素 Mg2+的浓度，以50nM为梯度进行调节； 引物浓度过高也会引起二聚体增多，一般使用浓度在50-500nM之 间，可降低引物浓度； Sybr-Green的浓度，Sybr-Green浓度越高对扩增的抑制越明显，同样会表现在二聚体较多 样品浓度的问题，如果引物设计不是十分完美，则在样品浓度较低时会表现出二聚体 ，如果必需操作低浓度的样品，则要从退火温度和引物设
9、计上再想解决方法,引物二聚体的解决（续）,4.软件操作、程序设置 用四步法可以去除引物二聚体，就是在PCR延伸之后加一个介于二聚体Tm与目片段Tm之间的温度,在这个温度采集信号即可，这样二聚体产生的荧光信号就检测不到,Cycle（40）,94 15s 59 20s 72 20s 83 采集信号,基因组DNA的污染,跨内含子的引物 将引物设在两个外显子的结合部，以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应 在内含子的前面设计5引物，在内含子的后面设计3引物，以基因组DNA 和cDNA 为模板的PCR产物大小不一样,达到去除污染的目的 2. 将RNA 提取物用RNase-free
10、 的Dnase I 处理，Dnase I灭活时RNA可能降解,跨内含子设计引物（一）,跨内含子设计引物（二）,PCR效率对实验结果影响,扩增效率低（扩增效率不一致）,扩增效率低，可适当提高体系中Mg2+的浓度，以50nM为梯度 降低Sybr-Green的浓度，一般在0.2-1之间调节 如果同时扩增两个基因，而扩增效率不一致，请首先明确以下问题： 两组引物的退火温度是否一致或接近 两条扩增片段长度和GC含量是否一致或接近 如果上述两点有一点不能满足就会导致扩增效率不一致，需从新设计引物 。特别是在做相对定量分析时，应尽量将两条目的片段的扩增长度和引物的退火温度设计接近,实例分析Case by c
11、ase,标准品稀释不规范：SYBR Green(R) I 2006-05-16 (1)wang.rex；SYBR Green(R) I 2006-06-11 (1)fu.rex 稀释样品的水污染：SYBR Green(R) I 2006-03-16 (2)fan.rex PCR管质量问题：Run 2006-07-06 FYD.rex；060721-1FYD.rex 试剂盒的问题：2005120701香港，Dual Labeled 试剂盒,实例分析Case by case（续）,荧光阈值的调节：051107-ct gz 二聚体的问题：SG-Qiagen-CD民院-2005-11-20，SG-Qiagen-CD民院- 2005-11-22 不同试剂盒在退火温度选择上的差异：SG-TaKaRa-CD民院-2005-11-20，SG-Qiagen-CD民院-2005-11-20 循环数对扩增结果的影响：SYBR Green(R) I 2005-12-21 (2),谢 谢!,
