《roche-lightcycler-480-中文操作说明》由会员分享,可在线阅读,更多相关《roche-lightcycler-480-中文操作说明(20页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、LightCycler 480 中文操作說明LightCycler 480 中文操作说明 罗氏医学仪器公司 / 应用科学部门February 2008 目录 一. 启动机器与软件3二. 软件设定 - 开启新实验5三. 样品编辑9四. 结果分析12五. 报告18六. 数据转移至其它计算机(数据输出与输入)19七. 使用者管理19一 启动机器与软件 启动机器1. 机器主开关位于机器右后方。 2. 机器正面两个警示灯代表机器状态。待警示灯 (右) 由闪烁橘色灯转变成稳定橘色灯,警示灯 (左) 由橘色转变成绿色 (约三分半钟),表示机器已经启动完成。左警示灯右警示灯机器状态橘 *闪烁*橘 *闪烁*正在
2、初始化绿橘机器启动完成96/384孔盘还未放入绿橘 *闪烁*96/384 孔盘正在放入中绿绿机器启动完成96/384 孔盘已经放入绿 *闪烁*绿 *闪烁*实验进行中3. 按压机器正面上唯一的按钮,放入已经封膜完成之 96 或 384 孔盘。放置完成后,左右两警示灯都呈现绿色。 启动软件1. 开启计算机,并以正确的使用者名称与密码登入 Windows。User name: OPERATORPassword: LC4802. 开启 LightCycler 480 软件,并输入正确的使用者与密码。 二软件设定- 开启新实验 设定新实验1. 软件开启后,会进入主画面。点选 “New Experimen
3、t”。2. 出现实验设定窗口。任何时候需要回主画面的话,点选画面右边的按钮。 设定实验v 若要套用设定好的实验步骤 (Template),请跳至 6.。1. 在实验设定画面上方,先选择适当的 Detection Format。选项包含: 另外可再点选 “Customize” 勾选所需的滤片组合。2. 输入反应体积: 96 well plate 范围为 10-100 ul,而 384 well plate 范围为 5-20 ul。3. 设定实验步骤 (Program) 设定 program,包含有 Pre-incubation, Amplification (PCR), Melting curv
4、e (optional) 与 Cooling。利用 +与 增加或删除步骤。 设定循环数目 (Cycle) 与分析模式。通常 Amplification (PCR) program设定成 Quantification,而 Melting Curve program 设定成Melting Curve。4. 设定详细温度变化 (依照不同实验方法与设计而有所不同) 点选各个 program 即可设定详细温度变化步骤,请根据产品说明书来设定,利用 +与 增加或删除步骤。需要设定的参数包含 Target () 目标温度,Acquisition Mode (荧光侦测模式),Hold (hh:mm:ss) 停
5、留时间。Ramp Rate (/s) 为升降温速度,范围如下:Ramp Rate (/s)Heating upCooling down96-well Block1.0 4.4 /s1.0 2.2 /s384-well Block1.0 4.8 /s1.0 2.5 /sv 若设定温度低于 50,请把 Ramp Rate 调整成 1.5/s (96 well) 或 2.0/s (384 well)。5. 将实验步骤储存成 Template以便下次进行套用。点选左下角 “Save As Template” 即可把此步骤储存起来。6. 若要进行套用时,请直接点选窗口左下角 “Apply Templat
6、e” ,选择欲套用之实验步骤即可。7. 设定完成后点选 “Start Run” 开始进行实验。8. 跳出档案储存窗口,请输入欲储存之文件名称。v 实验进行中会进入另一个 Data窗口,窗口下方按键功能如下: End Program : 结束此 Program, 进入下一个 Program。 + 10 Cycles : 实时增加循环数目。 Abort Run: 马上结束此实验,请注意,若按此键,则此次实验的结果将不储存。三样品编辑 将样品分群1. 点选窗口左边的 “Subset Editor”。2. 点选 “New” 新增新的群组,并将其命名。3. 利用鼠标选取此群组之样品位置,点选窗口右下角
7、“Apply” ,此时被选取的样品位置会呈现实心的蓝色,如下图。 4. 以此方式依序将所有样品群组编辑完毕。v 样品必须分群才能够独立分析,但是样品是否分群并不影响样品的 Cp 值。 编辑样品名称1. 点选窗口左边的 “Sample Editor”。2. 输入每个位置之样品名称 (Name)与重复 (Repl. Of)。3. 若要更快速输入,可直接在左边的图上点选欲编辑之样品:v 若 A1, A2 与 A3 为三重复,在A2 与 A3 Repl. Of 字段上都填上A1 即为三重复。v 在编辑过程中,可利用Ctrl+C复制文字,Ctrl+V贴上文字。4. 根据实验分析模式,编辑 Abs Qua
8、nt (绝对定量),Rel Quant (相对定量),或 Genotyping 分页,设定 Sample Type。20绝对定量 (Abs Quant): Unknown:未知浓度样品Standard: 已知浓度标准品相对定量 (Rel Quant):Target: 目标基因Reference: 参考基因Calibrator: Control 样品Standard: 已知浓度的样品Unknown:未知浓度样品v 其它分析模式之分页在此不赘述,请自行参考 LightCycler 480 Instrument Operators Manual。5. 若设定成 Standard之样品请输入浓度。6.
9、 若想要将此样品编辑储存成 Template,可点选窗口左下角 “Save As Template” 即可,下次实验时可点选 “Apply Template” 进行套用。四结果分析 点选左边的 “Analysis”,选取分析模式,并选择所需分析之群组,如下图:3.2.1.分析模式说明Abs Quant / 2nd Derivative Max绝对定量 (自动法)Abs Quant / Fit Points绝对定量 (手动法)Color Compensation色差校正 (多色实验校正用)Gene Scanning基因扫描 (适用于High Resolution Melting Curve, H
10、RM 分析)Genotyping基因分型 (适用于 HybProbe 之基因分型实验)Relative Quantification相对定量Tm CallingTm 分析 绝对定量 (Absolute Quantification)1. 点选下方的 “Calculate” 即可得到样品之 Cp 与标准曲线。各個樣品之 Cp 值與濃度重複樣品平均後之Cp值與濃度, 並自動計算標準差2. 数值之数据输出: 在数值分析表上按鼠标右键,点选 “Export” 即可输出成 .txt 档案格式。可直接以 Microsoft Excel 软件开启。3. 图形输出: 在图形上按鼠标右键,点选 “Export”
11、 即可输出成各种图形档案格式。4. 标准曲线储存: 点选窗口下方 Std Curve之 “Save as external” ,输入适合档名后即可储存在数据库中。 相对定量 (Relative Quantification)1. 在选择相对定量分析后,出现下面窗口: v Reference Sample Location: 若 Reference (Housekeeping gene) 之样品在同一盘上请选择 “In-Run”,否则请选择 “External” 可输入另一次实验的数据一起分析。v 建议将 Auto Pair 打勾让计算机自动将样品配对。2. 进入 Target与 Referen
12、ce分页,右下角显示 “Eff = 2” 表示将目标基因与参考基因的 PCR 效率以 2.0 来计算。 3. 若需要校正目标基因与参考基因之 PCR 效率,则需要输入标准曲线。在Target与 Reference分页之右下角,输入 (import) 标准曲线。 v Use in run:输入 (import) 同一盘上之标准曲线。v Use external:输入 (import) 之前已储存于数据库中之标准曲线。4. 点选 Pairing分页,检查计算机自动配对结果是否正确。其中,红色表示 Unknown样品,绿色表示 Calibrator 样品。若欲外加配对,则可直接以鼠标点选样品后按 “
13、Add” 即可增加配对。5. 点选 Results分页,点选 “Calculate” 即可得到计算结果。 6. 数值和图形输出与绝对定量相同。(请参考绝对定量) 基因分型 (Genotyping)1. 进入基因分型的窗口中。 2. 窗口右下角可设定分类方式v Auto Group:自动分组v In-run:标准品包含在本次实验中v External:标准品在之前已储存之实验中3. 点选 “Calculate” 即可得到分型结果。 Tm 分析 (Tm Calling)1. 进入 Tm 分析窗口 2. 确认波峰数目3. 选择检测模式4. 点选 “Calculate即可得到每个样品之 Tm 值。五报告 (Report)1. 将分析后结果储存后即可点选报告键。 数据储存报告2. 勾选想要呈现的报告内容。3. 点选 “Generate” 即可产生报告。