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1、荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例)细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔41031105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50M EdU培养基； 注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(24h)宜采用低浓度(110M)； 2)如果需配置10M EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考 96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.
2、5 cm 小皿EdU培养基100 l150 l200 l300 l500 l2 mL染色反应液100 l150 l200 l300 l500 l2 mL 注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入100L 50M EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间； 2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)； 1.3 PBS清洗细胞12次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA
3、的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。表2 EdU孵育时间设定参考 3T3HelaHEK293* 细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期30min3h18h21h25h5d孵育时间5min20min2h2h2h1d 注： 1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。表3 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考PubMed IDRefe
4、renceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS. 2008NIH3T3, Hela10 nM10 M1 hr18521918Cappella P,et al. Cytometry A. 2008HL-60, A2780, U2OS110 M30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009Neurospheres120 M24 hr19179371Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009Primary
5、 fibroblasts10 M1,2,4 hr19253396Warren M, et al. Dev Dyn. 2009Chick embryos10 M2 mM4 hr19647746Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009Spleen cells50 M24 hr19544417Momcilovi O, et al. Stem Cells. 2009Human ES cells10 M30 min20080700Cinquin O, et al. PNAS. 2010emb-301 M12 hr20025889Han W, et al. Life Sci
6、. 2009VSMC50 M2 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010ESC50 M2 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011fission yeast strains10 M3 hr20824490Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011EJ cells50 M4hr21248284Yang S, et al. Biol Reprod. 2011GC cells50 M2 hr21227924Zhang YW, et al. Nucleic Acid
7、s Res. 2011U2OS, HT2930 M90 min21829621Guo T, et al. PloS One. 2011HIT-T1550 M4hr21980430Zeng T, et al. PloS One. 2011MCF-10A25 M2hr22012572Ding D, et al. Int Orthop. 2011C3H10T1/210 M24hr22000787Zeng W, et al. Biomaterials. 2011EPC50 M4hr21913215Xue Z, et al. J Cell Biochem. 2011SGC790125 M24hr2201
8、6038Peng F, et al. Lasers Med Sci. 2011MSC50 M2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem. 2011HCC50 M2hr注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化 2.1 每孔加入50L 细胞固定液 (即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液； 注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。 2)可采用其他方式进行细胞固定。 2.2 每孔加入50L 2 mg/mL 甘氨酸，脱色
9、摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液； 注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤； 2.3 每孔加入100 L PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS； 2.4 (加强)每孔加入100L渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟;PBS清洗1次，5分钟。 注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo染色 3.1 每孔加入100 L的1X Apollo染色反应液(表3)，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液； 注：1)染色液用量与细胞量
10、相关，以覆盖细胞为宜(表1)； 2)孵育时间可以进行适当调整，调整范围为1030分钟。表4 Apollo染色反应液的配置参考(现用现配)配制顺序Apollo染色反应液500L*1 mL5 mL10 mL1去离子水469 L938 L4.69 mL9.38 mL2Apollo反应缓冲液 (试剂B)25 L50 L250 L500 L3Apollo催化剂溶液 (试剂C)5 L10 L50 L100 L4Apollo荧光染料溶液 (试剂D)1.5 L3 L15 L30 L5Apollo缓冲添加剂 (试剂E)5 mg9 mg44 mg88 mg 注：1)*表示通常配制的Apollo反应液的体积足以进行
11、510个孔(96孔板)染色； 2)按顺序配制适量1X Apollo染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)； 3)试剂E 为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换； 粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过20%。 3.2 加入100 L渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗23次，每次10分钟，弃渗透剂； 3.3 (加强)每孔每次加入100 L 甲醇清洗12次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。普通实验可以省略。DNA染色 4.1
12、用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存； 4.2 每孔加入100 L 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液； 4.3 每孔每次加入100 L PBS清洗13次； 4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100 L PBS保存待用。其他染色(自备) (可选)客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色(注：染料兼容性请参照表4)。图像获取及分析 建议染色完成后立即进行观测;如果条件限制，请避光 4 湿润保存待测，但不应超过3天。 注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要1s。表5 配套染料的相关波长信息C00031*Apollo 567550 nm565 nmCy3C00041Apollo 643653 nm667 nmCy5C00033*Hoechst 33342350 nm461 nmDAPI 注：1)*荧光显微镜宜采用Hoechst 33342及Apollo 567进行DNA复制活性检测； 2)激光共聚焦显微镜采用Apollo 567或Apollo 643均可。
