第八章节基因工程2011课件

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1、1,第八章,基因工程 Genetic Engineering,2,目的 获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作。 克隆（clone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的集合。,第一节 基因工程的基本原理,3,基因工程技术的基本原理,DNA克隆,又称分子克隆、基因克隆 / 重组DNA 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子， 继而通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子

2、。 实现基因克隆所采用的方法及其相关的工作统称重组DNA技术，又称基因工程。,4,第二节 基因工程的物质基础,一、工具酶 （一）限制性核酸内切酶 （二） DNA聚合酶 （三） DNA连接酶 （四） 其它DNA修饰酶,5,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。,+,Bam H,定义：,（一）限制性核酸内切酶 restriction endonuclease,6,作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类 、 （基因工程技术中常用型），

3、 型内切作用具有序列特异性。,7,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,8,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome) 反转对称结构。,限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。 切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5-P、3-OH的DNA片段。 限制酶切割DNA分子形成黏性末端(sticky end)和平末端(blunt end)两种 。,9,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口

4、,10,来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功异源酶（同裂酶）,11,来源不同，识别序列不同，但切割DNA后产生相同的粘性末端。 这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bgl,AGATCT TCTAGA,+,+,A TCTAG,GATCT A,同尾酶：,12,限制性核酸内切酶的星号活性: 不同限制酶需要不同的反应条件以获得最佳切割靶DNA的效率。 在非标准反应条件下会导致限制酶切割DNA的效率改变，即酶能切割一些与其特异性识别序列类似的序列，这种现象称为星号活性。 如EcoR1*,当它表现为星号活性

5、时，其特异性由6 nt GAATTC降为4 nt AATT。 有些酶有星号活性，有些没有。,13,（二）DNA聚合酶,大肠杆菌DNA pol 具有53聚合酶活性。53外切酶活性，3 5外切酶活性。 制备DNA探针、DNA序列测定。 2. Taq DNA聚合酶 具有53聚合酶活性，53外切酶活性， 用于PCR反应和DNA序列测定。,14,3. 逆转录酶 主要2种，禽成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶和Molonev小鼠白血病病毒MMLV逆转录酶。 53DNA聚合酶活性，RNase H活性。 用途：以mRNA为模板合成cDNA。 4. Klenow酶 DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶水解后产生的大片段。具有

6、53聚合酶活性，35外切酶活性。 用途：填补DNA双链的3末端，合成cDNA第二链，DNA序列分析。,15,（三）DNA连接酶（DNA ligase） 是基因工程中所必需的一类酶。它能催化DNA中相邻的5-磷酸和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链切口连接起来，形成完整DNA分子。 分大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶：只能连接双链DNA的单链切口。 T4DNA连接酶：不仅具有前者的作用，而且在高浓度的酶和ATP存在下，还可将平端DNA片段连起来。,16,碱性磷酸酶 切除DNA或RNA 5端磷酸基。 末端转移酶 催化脱氧核糖核苷酸逐个地加到DNA的3羟基末

7、端。底物分子可以是具有3-OH末端的ssDNA，具有3-突出末端的dsDNA，某些条件下还可以是3-平端的dsDNA。 可使外源DNA片段及载体分子的3-OH加上互补的同聚物，形成人工黏端，或用于DNA3端末端标记。,T4 多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase) 催化ATP的-位磷酸转移到DNA分子的5-羟基末端。,17,二、基因载体（vector）,定义 能携带外源DNA分子进入受体细胞并进行扩增和表达的运载工具。,常用载体 质粒DNA, 噬菌体DNA, 病毒DNA.,18,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而设计的载体称为克

8、隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列被转录翻译而设计的载体称为表达载体。,基因载体种类,19,（一）克隆载体 1. 质粒载体 2. 噬菌体载体 3. 酵母人工染色体载体 （二）表达载体 1. 大肠杆菌表达载体 2. 真核表达载体,20,基因载体应具备的条件：,具有自主复制能力； 有多个单一限制酶的酶切位点或多克隆位点（multiple cloning sites，MCS），为多个限制酶的单一位点，便于外源基因的插入。 具有一个或多个选择性遗传标记：抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶（Lac Z) 、营养缺陷型 分子量小，能容纳较大的外源DNA分子； 具

9、有较高拷贝数，易于与受体细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯； 具有较高的遗传稳定性。,21,（一）克隆载体 1. 质粒 2. 噬菌体载体(bacteriophage，phage)（略） 3. 酵母人工染色体 （略）,22,1. 质粒 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的双链环状DNA分子。 常用的质粒载体有pBR322、pUC系列及TA克隆载体等多种。,23,特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。 宿主细胞：细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞。,24,2.有关的克隆质粒 （1）pBR322： 4.3kb 带有一个复制起始

10、点 含 ampr 和 terr 抗性基因、 含有多个单一限制性酶切点，插入失活。 具有较小的分子量，易于自身DNA纯化，可携带6kb的外源基因。 具有较高的拷贝数。,pBR322 4363bp,25,（2）pUC系列：2.6kb,在PBR322质粒载体的基础上改建而成，保留PBR322质粒的一部分，插入了来自M13噬菌体并带有MCS的LacZ基因。 组成： 复制起始位点、 pBR322的ampr（该基因的序列发生改变，不具有原来的酶切位点） Ecoli LacZ基因 MCS，来自M13噬菌体，位于LacZ基因中近5端，不破坏LacZ基因的功能。 pUC系列大多数是成对的：每一对（pUC18、p

11、UC19)质粒的MCS中的酶切位点数目相同，顺序相反 。,26,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,27,（3）TA克隆载体专门为克隆PCR产物而设计的一种特殊质粒载体。 其共同特点是在其MCS两侧的3端携带有未配对的T碱基、MCS均位于-半乳糖苷酶的片段内、都含有T7启动子。 由于大部分耐热的DNA聚合酶（Taq、Tth）扩增时都会有在PCR产物的3端加上一个A，可与载体的3端T互补连接，同时3端突出的T还可以防止载体自身环化，提高PCR产物的连接和克隆效率。 带有ampr 和LacZ 基因，可方便筛选阳性克隆。 优点：直接克隆PCR产物。 常见的TA载体： pBS-T， pGM-T和p

12、CF-T,28,天根生物,29,二、表达载体 expressing vector,表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体，它除了具有克隆载体所具有的性质外，还需要有能表达外源基因所必需的DNA序列（如启动子、核糖体结合位点和转录终止调控序列等）。 表达载体： 一个强启动子及其两侧的调控序列； 有SD序列,该序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离； 在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架； 外源基因下游有转录终止子等,30,按宿主细胞的不同，可将表达载体又分为： 原核细胞表达载体、 酵母细胞表达载体、 哺乳动物细胞表达载体、 昆虫细胞表达载体。,31,（一）大肠杆菌表达载体 表达：融合蛋

13、白、非融合蛋白、分泌型蛋白。 表达载体构建： 启动子、 核糖体结合位点（起始密码子(ATG)和SD序列） 转录终止信号,T 7 噬菌体启动子：表达效率高 T 7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的p ET系统为杰出代表。 它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。 强大的T 7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T 7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T 7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达

14、目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。 因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。,大肠杆菌表达载体,pRSET载体 它是一个两用载体，它既可作为表达融合型蛋白的载体，也可作为表达非融合型蛋白的载体。 该载体含有Amp抗性基因和一个强的T7噬菌体启动子，在启动子与终止信号之间有RBS和多克隆位点。 在RBS后紧接着的是起始密码子（ATG），在起始密码子与多克隆位点之间有一段大肠杆菌基因编码序列，编码一个31个AA的多肽，C端是一个肠激酶识别位点。 用肠激酶水解去除大肠杆菌多肽，得到应表达的蛋白质。,34,High-level expressi

15、on from the bacteriophage T7 promoter N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond resin(树脂) N-terminal Xpress epitope（表位） for protein detection with the Anti-Xpress Antibody Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag,35,2. 真核表达载体,包括质粒载体和病毒载体。 质粒载体： 结构包括： 1. 原核序

16、列： coli中ori 、抗生素抗性基因（如Ampr ） 2. 真核表达组件：启动子、增强子、克隆位点、药物抗性基因（Neor）、终止信号和polyA加入的信号序列 如：pcDNA3.1： CMV启动子、多克隆位点、原核细胞复制起始点、Amp抗性基因、Neo抗性基因、小牛生长激素polyA。,36,病毒载体：病毒载体有良好的转染效率和靶向性。 腺病毒载体： 逆转录病毒： 腺相关病毒载体： 存在问题： 重组的逆转录病毒不稳定，在病毒复制过程中外源基因易发生重排与丢失。,37,第三节 基因克隆的基本过程,基因克隆的基本过程主要应包括： 目的基因的获取； 基因载体的选择与构建； 基因载体与目的基因的连接（构建DNA重组体）； DNA重组体导入受体细胞； 含DNA