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1、ChIP实验步骤第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎1. 交联前的准备工作（1）细胞准备：对细胞进行一定条件的处理，以确保目的基因的转录激活。细胞密度应达到1106细胞/10 cm培养皿。（2）配制1甲醛溶液：270 l 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可，应使用高质量的甲醛。2. 交联与超声破碎优化超声条件，以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp1000 bp的片段，具体操作如下（以HepG2细胞为例）：（1）小心吸出细胞培养液，加入1甲醛溶液10 ml，37孵育10 min，然后置冰上5 min终止固定。（2）小心尽量吸净培养液，用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。（
2、3）加入预冷的内含PMSF（10ul）的PBS 1 ml。刮取细胞并移至离心管中，于4以1200 rpm（约3000 g）离心5 min，小心移走上清液，得到细胞沉淀（细胞沉淀可于-80保存数月）（4）以200l SDS裂解缓冲液重悬细胞（含PMSF：2ul），冰上放置10 min（5）冰上超声剪切染色质DNA，使其成为200 bp1000 bp的片段（10个脉冲，每个20 s，脉冲间隔20 s）（6）加入5M Nacl 8 l，65，4h至过夜，以解交联（7）琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果（所获超声剪切物可于-80保存数月）。第二部分、免疫共沉淀如果超声条件优化已经优化好，在步骤“（一）.2(5
3、)”后，进行下列步骤。对于阴性对照，采用下述步骤“5”所述。接上述2(6)1. 4 ，13,000rpm离心10min，转移上清至2ml离心管中。2. 以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800l，稀释200l的上清至2ml。3. 为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子，加入75 l蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4旋转孵育30 min。4. 4, 以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂，将上清转移至新的离心管中。并从这2ml中取出20l作为“input DNA”对照。5. 将上清分为两份，一份加入针对DNA结合蛋白的特异性抗体2g，另一份加强如抗体阴性对照（IgG）2g，4旋转孵育过夜（
4、孵育时间可视情况而调整）。6. 加入60l 蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4旋转孵育60 min以收集抗体/转录因子复合体。7. 4, 以1000 rpm离心1 min，小心移除上清（内含未结合及非特异DNA）。8. 按以下顺序洗涤蛋白A/抗体/转录因子/DNA复合物，每种缓冲液加0.5ml，旋转孵育3min，然后4, 1000 rpm离心1 min，弃上清液。（1） 低盐洗涤缓冲液，1次；（2） 高盐洗涤缓冲液，1次；（3） LiCL洗涤缓冲液，1次；（4） TE缓冲液，2次第三部分、洗脱与转录因子结合的DNA1. 配制新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS, 0.1M NaHCO3, 按照1：9体积比
5、配制）。2. （接（二）.8）向蛋白A-琼脂糖/抗体/抗原/DNA复合物中，加入200 l洗脱缓冲液，轻弹管壁混匀，室温放置5min. 1200 rpm离心1 min，收集上清液。3. 向洗脱上清及放置在一边的“input DNA”管中，分别加入5 mol/L NaCl 20 l，65水浴4 h,以解交联。短暂离心收集管壁液体（该样品可-20保存）。4. 加入0.5 mol/L EDTA 10 l，1 mol/L Tris-HCl（pH6.5）20 l，10 mg/ml的蛋白酶K 2 l，45孵育10min。5. cycle-pure法回收DNA，-20保存样品 加入400l PC缓冲液，混匀
6、后12000 rpm离心1 min过柱 以500l wash buffer 12000 rpm离心1 min洗柱，弃滤液； 12000 rpm离心空柱1min，然后将柱置入一新的EP管中，加入30l ddH2O，12000 rpm离心收集DNA第四部分、DNA样品PCR分析以上述溶解于ddH2O中的DNA作模板，利用特异性引物进行PCR。应使PCR终止于线性反应时段（具体PCR参数和循环次数应进行优化）。最后通过对扩增产物进行电泳（乃至于测序）来分析蛋白质所结合的DNA情况。1. PCR体系 TaKaRa Taq （5 U/l）0.1 l10PCR Buffer（Mg2+ free）Mixture 7.6l2.5 ldNTP Mixture（各2.5 mM）2 lMgcl2 l上下游引物 1 l模板DNA1l灭菌蒸馏水16.4l 总体积25 l2. PCR条件95 4min95 30 sec. 55 30 sec. 25 Cycles 72 30 sec3. 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果
