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1、细菌多细菌多样性分析样性分析16S rRNA 细菌核糖体 RNA（rRNA）有三种类型：5S rRNA（120bp） 、16S rRNA（约 1540bp）和 23S rRNA（约 2900bp） 。5S rRNA 基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析 鉴定；23S rRNA 基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细 菌种类；16S rRNA 普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌 RNA 总量的 80%以上） ，便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌种群分析的标 准。 细菌多样性分析的流程图如下： 1. 基因组基因组
2、DNA 提取提取 DNA 的提取是整个宏基因组学研究的第一步，也是至关重要的一步。提取出来的 DNA 必须能够代表样品中所有存在的细菌，同时对于 DNA 的总量和质量也都有较高的要求。微 基生物根据多年实验经验及摸索，根据不同来源的样品，采用适合的方法，保证 DNA 的质 量。 2. 文库构建文库构建 （1）引物设计）引物设计 16S rRNA 基因由 9 个可变区 （variable region） 和 9 个保守区组成 （constant region） （图 1） 。可变区拥有与进化距离相匹配的序列变化，能够体现物种间的差异，是细菌分类研究的 理想材料；保守区的序列基本恒定，反应了微生物
3、物种间的亲缘关系，可利用其设计引物以 扩增 16S rRNA 基因片段。 图1 16S rRNA不同V区及其引物 针对不同的 V 区，均有相应的引物可以对其进行扩增、比对（图 1） 。有学者分别对不 同 V 区及其组合进行可全面的比较分析，研究发现，V4-V5 区其特异性好，数据库信息全， 是 16S rRNA 基因分析注释的最佳选择。 （2）文库构建）文库构建 两步 PCR 扩增法 根据illumina MiSeq高通量测序要求， 进行双向测序， 设计16S V4-V5区域和带有“5MiSeq 接头-barcode-测序引物-特异引物-3”的融合引物。并采用两步 PCR 扩增的方法构建文库。
4、 图 2 两步 PCR 扩增示意图（来自 Illumina 官方说明） 低偏差扩增（Low-Error Amplicon sequencing PCR, LEA-Seq PCR） 根据发表在 Science 上 的文献报道， 采用 LEA-Seq 的方法对普通两步 PCR 扩增法进行优 化，形成自己的一套低偏差扩增建库的方法。 LEA-Seq 扩增的原理为，首先加入低浓度的内侧反向引物，进行少数循环的目的片段扩 增；随后加入内侧正向引物及外侧的正、反向引物，再进行目的片段的指数扩增。其示意图 如图 4 所示： 图 4 LEA-Seq PCR 示意图 3. 高通量高通量测序测序 目前市面上常用的
5、用于研究环境微生物的高通量测序平台有 Illumina MiSeq，Roche 454 和 Ion Torrent PGM。针对于细菌的 16S rRNA 基因序列分析，MiSeq 凭借其测序读长长、测 序周期短、通量大等特点，成为使用最为普遍的测序平台。 微基生物是国内首家采用 illumina-MiSeq 2300 bp 平台进行微生物生态研究，其最大 读长可达到 550 bp，适合对 V3、V4、V5 区及 V3-V4、V4-V5 区进行测序分析。 4. 生物信息分析生物信息分析 5.分析分析结果结果 案例分析案例分析 标题：由长期的土壤移植引起的纬度和气候变化明显改变了土壤微生物的变化
6、率 The ISME Journal (IF: 9.302) 研究领域：研究领域：土壤微生物 分析物种及采样方法：分析物种及采样方法： 分析物种：细菌 取样方法： 从中科院封丘站取 1.4*1.2*1.0 体积的土壤， 分别向北移植到黑龙江海伦站， 向南移植到江西鹰潭站。 每组设 3 个重复， 于 2006-2011 年每年的 8-9 月取 20 cm 的表层土， 密封在聚乙烯包装袋中，于-80C 保存。 高通量测序平台：高通量测序平台：Illumina MiSeq 2150 测序区域：测序区域：16S rRNA gene V4 区 样本数及分组：样本数及分组：分 3 组，3 个重复，共 63
7、 个样本。 研究背景：研究背景： 生物群体对由某些人为因素造成的潜在威胁 （如气候改变） 的响应是目前生态学研究的 一个重要挑战。 鉴于微生物在生物地球化学循环中的重要作用， 它们对气候改变的响应有可 能导致生态结构的改变。之前已有研究指出，温度是影响土壤微生物组成和生态功能（土壤 的呼吸作用、有机物的含量、固氮水平）的重要因素。而不同地域之间的土壤移植为研究微 生物群落对气候变化的响应提供了新的研究方法和思路。 主要结果：主要结果： （1）微生物的演替）微生物的演替 随着时间的推移，向北、向南移植的土壤中，微生物的群落组成差异越来越大，微生物 多样性逐渐增加。 （2）由土壤移植引起的土壤微生
8、物的变化由土壤移植引起的土壤微生物的变化 微生物随时间衰减的斜率可以用来衡量微生物群落的相似性。 本研究中， 在各个样本的 微生物群落中都存在显著的的时间衰减关系。向北、向南移植的土壤中，微生物随时间衰减 的斜率均比原位土壤的斜率大，尤其是在向南移植的土壤中。 随着温度的升高/降低， 微生物的变化率也相应地增加。 随着土壤向南移植， 气候变暖， 微生物群落的波动性增大， 微生物群落的变化增加。 向南移植对土壤微生物群落的变化具有 出更好的效果。有趣的是，研究还发现细菌群落（门水平）的改变与分类学的分度有关。其 中变形菌门、拟杆菌门和疣微菌门与门的丰度呈负相关，而酸杆菌门、放线菌门、后壁菌门 和
9、浮霉菌门与门的丰度呈正相关。 （3）细菌群落及细菌群落及系统进化树系统进化树分析分析 在为期六年的试验中，三个样本共检测出 78 个 OTUs，其 OTU 的数量非常少，分属于 9 个门。用 MEGA 5 作系统进化树，如下图所示。 其中， 酸杆菌门中的 Gp4 和 Gp6、 节细菌属、 硝化螺菌属、 鞘氨醇单胞菌、 Fervidicoccus、 Sphingosinicella、Steroidobacter 和 Terrimonas 是主要菌群。 （4）微生物演替与环境因子的关系）微生物演替与环境因子的关系 微生物的演替与环境因子之间的关系用 CCA 分析如下。 结果表明， 向北移植的土壤中
10、， 微生物群落的多样性与土壤的物理化学因子有关； 而向南移植的土壤中， 微生物群落的多样 性受温度和降水的影响较大。 本研究采用 illumina MiSeq 测序平台，对经过移植的土壤微生物为研究对象，扩增了细 菌 16S rRNA 基因的 V4 区域，从而得到土壤中细菌种群分布的相关信息，对其中的微生物种 群变化进行了调查研究。 此实验采用 illumina MiSeq 2*150 双端测序，每个样品可得到 948,765 条序列，其中有 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Relative abundance Samples Verru
11、comicrobia Proteobacteria Nitrospira Gemmatimonadetes Firmicutes Chloroflexi Bacteroidetes Armatimonadetes Actinobacteria Acidobacteria CCA1 (21.3%) -3-2-101234 CCA2 (18.8%) -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 pH EC NO3- NH4+ Temperature Rainfall CEC TK AK TP SOM Biomass In situ Northward Southward Yield 效序列为 10,
12、947 条。研究发现，与原位土壤相比，向北移植（低温）的土壤中，细菌的丰 度增加，演替速率升高；向南移植（高温）的土壤中，细菌的丰度降低，而演替速率达到最 高， 即稳定性不好。 推断这是由于高温环境容易引起高的代谢率和更加激烈的生存竞争造成 的。 原文链接：原文链接：http:/ 参考文献：参考文献： (Liang, Jiang et al. 2015) Liang, Y., Y. Jiang, F. Wang, C. Wen, Y. Deng, K. Xue, Y. Qin, Y. Yang, L. Wu, J. Zhou and B. Sun (2015). “Long-term soil transplant simulating climate change with latitude significantly alters microbial temporal turnover.“ ISME J.
