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1、1、 DNA、RNA的一级结构，二级结构2、 DNA的变性、复性特点，影响因素3、 翻译的步骤，参与的蛋白质因子，GTP计算4、 tRNA的结构，几种主要的稀有碱基，校正tRNA的原理5、 PCR的原理，发明人，Nobel prize time6、 China contribution in Human genome project我国于1999年参与人类基因组计划，承担其中1%的测序任务。7、 Structure and organization of bacterium promoter(细菌启动子) Promoter启动子：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚
2、合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列位点。启动子本身不被转录。 细菌启动子普遍具有以下基本特征：含有转录起始点，-10序列、-35序列以及在-10序列与-95序列之间较严格的距离。 启动子区域的功能：-35区序列可增强启动子与聚合酶因子的识别作用。-10区序列对于DNA解旋作用十分重要。起始位点附近的序列影响转录的起始效率。8、 SD sequence （SD序列）书P331细菌的mRNA通常含有一段富嘌呤碱基的序列，称作SD序列。位于起始AUG序列上游10个碱基左右的区域，能与细菌16s核糖体RNA 3端反SD序列7个嘧啶碱基进行互补识别,以帮助从起始AUG处开始翻译.一般为AGGA或GG
3、AG。9、 乳糖操纵子的原理，色氨酸衰减子的原理乳糖操纵子机制： 培养基中没有乳糖时，存在操纵子上游的调节基因编码表达的阻遏蛋白结合到操纵子的操纵基因上，组织了结构基因于的表达（即不能调节基因编码表达的阻遏蛋白所阻遏）不能合成乳糖代谢的酶。当转到乳糖培养基中时，由于诱导物分子结合在阻遏蛋白的特异部位，引起阻遏蛋白的构像变化，不能结合到操纵基因上，使RNA聚合酶能够正常催化转录存在于操纵子上的基因，即操纵子诱导表达，-半乳糖苷酶分子数量迅速增加。 乳糖操纵子的结构：长约5000个碱基对，有3个结构基因，分别为lacZ、lacY、lacA，可编码3种酶。 色氨酸衰减子（弱化子）的原理（色氨酸操纵子
4、转录的弱化效应） 衰减子对RNA聚合酶转录的终止依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置，而细胞中Trp存在与否，决定了mRNA转录的弱化子结构，使弱化子中1.2.3.4区域呈现竞争性配对，从而产生了弱化效应乳糖操纵子结构和功能：细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，一开俱开，一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位，其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中，例如编码透过酶的基因，虽它的产物不直接参与催化代谢，但它可以使小分子底物转运到细胞中。乳糖分解代谢相关的三个基因，lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇。它们的产
5、物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。它们具有顺式作用调节元件和反式作用调节基因。三个结构基因图的功能是：lacZ编码-半乳糖苷酶，此酶由500kd的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖lacY编码一半乳糖苷透性酶，这种酶是一种分子量为30kDd膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。lacA编码-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。无论是lacZ发生突变还是lacY发生突变却可以产生lac-型表型，这种lac表型的细胞不能利用乳糖。 lacZ-突变体中半乳糖苷酶失去活性，直接阻止了乳糖的代谢。lacY-突变体不能从膜上
6、吸取乳糖。这一个完整的调节系统包括结构基因和控制这些基因表达的元件，形成了一个共同的调节单位，这种调节单位就称为操纵子（opron）。操纵子的活性是由调节基因控制的，调节基因的产物可以和操纵子上的顺式作用控制元件相互作用。lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上（这是典型的反式-作用调节物。）通过突变的效应是可以将结构基因和调节基因相区别的，结构基因发生突变，细胞中就失去这些
7、基因合成的蛋白。但是调节基因发生突变会影响到它所控制的所有结构基因的表达。调节蛋白的突变的结果可以显示调节的类型。lac基因簇是受到负调节（negative regulation）。它们的转录可被调节蛋白所关闭。若调节蛋白因突变而失活就会导致结构基因组成型表达。表明调节蛋白的功能是阻止结构基因的表达，因此称这些蛋白为“阻遏”蛋白。乳糖操纵子的阻遏蛋白是由4个亚基（38kDa）组成的四聚体。一个野生型细胞中大约有10个四聚体。调节基因转录成单顺反子的mRNA，它和操纵子的比率与RNA聚合酶和启动子之比是相似的。lacI的产物称为lac阻遏物（lac repressor），其功能是和lacZ、Y、
8、A基因簇5端的操纵基因（Olac）,操纵基因位于启动子(Plac)和结构基因（lac2yA）之间。当阻遏物结合在操纵基因上时就阻碍了启动子上的转录起始。Olac从mRNA转录起始点的上游-5处延伸到转录单位+21处。这样它和启动子的末端发生重叠。新近的观点认为阻遏物影响了RNA聚合酶，从操纵基因和启动子二者相关位置来看阻遏物结合在DNA上会阻碍RNA聚合酶转录结构基因。但我们必须注意其它一些操纵子上的操纵基因其位置和乳糖操纵子并不相同，因而阻遏蛋白可以通过多种方式与操纵操纵基因结合阻断转录。色氨酸衰减子：当细胞中色氨酸含量高时，一般是不会合成色氨酸的，在转录水平就会中止，但有时候阻遏蛋白实效或
9、其他原因导致合成色氨酸的转录开始，由于原核生物的转录与翻译是耦联的，在进行翻译时，色氨酸操纵子使转录的好的DNA片段结构发生变化，使转录中止。意义：转录水平上的调节，控制转录10、 Components and functions of protein factors in DNA replication复制的起始1.螺旋的松弛与解链拓扑异构酶-能改变DNA空间构像的酶 作用：DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉的行进及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化体外拓扑异构化反应，拓扑异构酶分两型。拓扑异构酶I （topoisomerase- I ）作用：松弛超螺旋，不需ATP, 作用
10、机制：切开环状一条链、打结与解结原核：拓扑异构酶I对负超螺旋作用正超螺旋 真核：拓扑异构酶I对正、负超螺旋均有作用。拓扑异构酶-旋转酶（gyrase）作用：松弛超螺旋，作用机制： 切开环状两条链、打结与解结、环连与解环连解链酶 （helicase）-复制蛋白rep 作用：ATP供能时，解开DNA双链。 原核：编码解链酶的基因是dnaB。前导链结合rep蛋白，随从链结合解链酶II、单链结合蛋白（SSB）作用：SSB与解开DNA单链结合，保护稳定DNA。与新复制DNA单链结合，以防其降解。螺旋松弛与解链过程如图所示2.引发引物酶（primase）作用：以DNA为模板，自53合成RNA小片段约十几到
11、几十个核苷酸， 3末端为-OH。原核：dnaG基因编码DnaG蛋白即引物酶。引发前体（preprimosome） 由多种蛋白因子组成复合物。作用：合成RNA引物，沿随从链复制叉的行进方向移动，在不同部位，合成RNA引物。小结：合成RNA引物，在引物3-OH末段进行DNA片段合成。 DNA链的延长反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+反应式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi真核与原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）：有几种类型，作用方式相同，但各具特性及功能。1.大肠杆菌DNA聚合酶（3种）pol I：催化53的聚合作用，合成20个核苷酸
12、即离开模板，填充空隙。35外切酶活性，去除错误碱基，有校对作用。53外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。pol II：催化53 DNA合成并具有35外切酶活性，体内功能不清楚。pol : DNA链延长起主要作用，细菌中以1000dNTP/秒进行聚合反应。 35外切酶活性，校对作用，与pol I配合使错误率降至10-6。如图所示DNA复制的保真性：遵守严格的碱基配对规律。-聚合酶对碱基的选择功能。聚合酶对错误碱基的校读作用。以上三种作用确保了DNA复制的准确性。2、真核生物DNA聚合酶特性与大肠杆菌相似，共五种：、pol：催化前导链及随从链的合成，需增殖细胞核抗原蛋白PCNA的参与。pol
13、：与引发酶配合，参与随从链的合成。 RFA（replication factor A）：DNA延长中RFA与单链结合起到SSB的作用。终止：连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3,5磷酸二酯键相连，需ATP供能。 11、 Degeneracy of condon,摇摆假说，反密码子中的AUCGI分别可以和几个碱基配对（最多可以和4个碱基配对）摆动假说：由克里克1966年提出。此假说课解释密码子第三位的简并性。即当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时前两个碱基严格遵守碱基互补配对法则，但第三个碱基有一定的自由度。也称三中读二（2 out of 3 reading）反密码子5 端碱
14、基密码子3 端可配对碱基GCAUI（次黄嘌呤）U或CGA或GA、U或C一个反密码子最多可识别4个密码子。12、 起始密码和终止密码，最多密码和最少密码的A.A起始密码子：AUG(甲硫氨酸) GUG（缬氨酸）某些微生物的起始密码就是GUG 大多数生物是以AUG为起始密码终止密码子：UAG,UAA,UGA最多密码 6：Arg精氨酸 Leu亮氨酸 Ser丝氨酸最少密码 1：Met甲硫氨酸 Trp色氨酸13、 复制、转录、翻译的抑制剂复制的抑制剂一、 与DNA共价结合的抑制剂这类抑制剂可与DNA共价结合使其失去模板功能。1、 丝裂霉素临床常用的丝裂霉素C和自力霉素、甲撕裂霉素属这一类。2、 烷化剂包括
15、氮芥、乙撑亚胺、磺酸酯等。鸟嘌呤烷基化后极不稳定，易被水解脱落，留下的空缺可导致错误碱基掺入。烷基化的鸟嘌呤亦可与胸腺嘧啶错误配对，影响DNA的正常复制。烷化剂一般都有较强的毒性，甚至细胞突变导致癌变。二、 作用域DNA复制酶类的抑制剂1、 DNA聚合酶抑制剂膦羟基乙酸：是一种人工合成的低分子有机酸，能选择性抑制病毒DNA聚合酶，而对宿主细胞DNA聚合酶的抑制能力仅为1%一下。因此选用低浓度膦羟基乙酸，即可有效地一直疱疹病毒和痘病毒的增值，而对宿主细胞DNA合成基本上没有影响。对RNA或蛋白质的合成也无影响。这类抑制剂还有特意地抑制DNA聚合酶III。2、 DNA旋转酶（拓补异构酶II）抑制剂萘啶酮酸可专一地与细菌nalA蛋白结合，抑制DNA旋转酶。香豆霉素和新生霉素是链霉素衍生物，亦可与DN
