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1、一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1.提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。, DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点， 选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解， 而使杂质沉淀；,或者让其他成分溶解， DNA析出,3.DNA等大分子的理化性质, DNA不溶于酒精溶液, DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,4、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度
2、的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低
3、。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。, DNA不溶于酒精溶液, DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性, 蛋白酶水解蛋白质， 对DNA没有影响, 高 温大多数蛋白质不能忍受6080 而DNA在80以上才会变性, 洗涤剂瓦解细胞膜， 但对DNA没有影响,试剂：,（二）DNA的鉴定,条件：,二苯胺,沸水浴条件下， DNA与二苯胺反应呈现蓝色,沸水浴,现象：,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）除去滤液中的杂质(纯化),（四） DNA的析出与鉴定,二、实验设计,（一）实验材料的选取
4、,从下列材料中选取23种,原则：,菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大,材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）,思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？,不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血
5、细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,2、植物细胞 植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到
6、丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,思考：加入蒸馏水的目的是什么？,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA ）,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,思考：这个步骤过滤获得什么？,获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）,思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）,1. DNA的溶解性
7、,（三）除去滤液中的杂质,方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,思考：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？,目的是使DNA充分溶解,思考：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？,含DNA的滤液,思考：这一步过滤的目的是？,含DNA的滤液，除去不溶的杂质,DNA的析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA
8、析出。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.10.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。,注意：在析出DNA的黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加,思考：加蒸馏水的目的是？,调节NaCl溶液物质的量为接近014mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出,思考：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）,稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物,思考：这一步过滤含DNA黏稠物的014mol/L的NaCl溶液，获得什么？,获得DNA黏稠物（ 纱布上
9、的DNA黏稠物）,思考：过滤的目的？,获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质； 2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA 与蛋白质分开； 方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同， 使蛋白质变性，与DNA分离,（四） DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)， 静置23min，溶液中会
10、出现白色丝状物 粗提取DNA 用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌),卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA,2. DNA的鉴定, 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml 其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解 向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml 混匀后，置于沸水浴中加热5min 待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：,溶解丝状物的溶液变为蓝色,1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要
11、轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,二苯胺试剂的配制 称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。,三、操作提示,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（
12、一）是否提取出了DNA,（二）分析DNA中的杂质,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 获得含核物质的滤液 过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液 获取纱布上的DNA粘稠物 过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液 得到含DNA的滤液,本实验中有三次过滤 ,获得什么？,第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液 加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液 目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中 第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液 稀释NaCl溶液,析出DNA
13、黏稠物 第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物 使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中 第五次搅拌体积分数为95%的酒精,实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?,卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA,本实验两次用蒸馏水,第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 第二次：调节NaCl溶液物质的量为014mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出,本实验两次析出DNA,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液析出DNA，过滤 除去溶液中的杂质,第二次：用冷却的95的酒精，获得含杂质较少的 DNA丝状物（利用DNA容易酒精溶液，但是细
14、胞中的 某些蛋白质则溶于酒精）,实验成功的关键及注意事项,1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min,2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用,3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子,4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失,1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够,实验现象不明显的原因分析,2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏,3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果,4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果,5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）,
