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1、生物芯片和高通量测序技术及其应用,中国科学院上海生命科学研究院 系统生物学重点实验室 生物芯片上海国家工程研究中心,肖华胜博士,Email： ; huasheng_ 电话：54920101；513202885221。,第一部分 概述 第二部分 基因芯片 第三部分 蛋白芯片 第四部分 组织芯片 第五部分 其他形式的芯片 第六部分 高通量测序技术及其应用,主要内容,人类基因组研究战略和实验技术源源不断地产生了日益庞大及复杂的基因组数据，这些数据已被载入公共数据库，并改变了对几乎所有生命过程的研究。,3,第一部分 概 述,“人类基因组计划”和“曼哈顿”原子弹计划,“阿波罗”登月计划，一起被誉为自然科
2、学史上的“三大计划。,图片来源：Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside Nature Volume: 470, Pages: 204213 Date published: (10 February 2011),Human Genome Project (HGP),In 1990 the HGP was initiated. 26th June 2000 International Consortium announced that the HGP draft finished. 4th April 20
3、03, Collin Francs announced the HGP finished.,Nature. 420(6915):520-62.2002,Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome,Mouse Genome contained about 30000 genes。 Rodent animal and human have 85% homologue in DNA sequence.,Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights in
4、to mammalian evolution,National heart, lung and blood institute initiated the rat genome project in 1995. The draft sequence was finished in 2001 and published the the comparative paper in 2004.,Nature 428, 493 521， 2004,Whole genome sequence of Oryza sativa ssp indica and the finishing sequence of
5、Chr. 4 of O. sativa ssp japonica,39种类病毒、2115种病毒、 58种古菌 1272种细菌(包括51种蓝藻)、 69种真菌、 29种原生生物， 10种植物 78种动物。,已经完成的基因组测序,共3,670个物种,转录组,测序技术,基因芯片,SAGE,蛋白质芯片,差异显示、RDA（代表性差异分析）,Northern Blot,基因组,蛋白质组,(DNA),(RNA),(Protein),新一代测序技术,生物芯片和测序技术是系统生物学研究的重要技术,生物芯片概念的提出,生物芯片的概念是Fodor等人于1991年提出(Fodor et al., 1991, Scie
6、nce)。 生物芯片的概念：是借用电子芯片的概念，是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件，它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法，只是由于其所处理和分析的对象是生物样品，所以叫生物芯片(Biochip)。 高通量，平行化，微量化的分析手段。,生物芯片的分类,基因芯片,cDNA芯片,Oligo芯片,信息生物芯片,蛋白芯片,生物芯片,微流体芯片,功能生物芯片,芯片实验室,组织芯片,（微阵列芯片）,（微流控芯片）,生物芯片的发展历史和趋势（1）,DNA芯片： 在90年代初期，利用光原位合成的原理，在基质上固定高密度的寡核苷酸的DNA测序芯片。 1
7、995年Schena (Science, 1995)等人，把拟南芥的45个基因固定在一张玻片上，并行检测拟南芥45个基因的表达情况，这是第一次结合了高精度机械手点样系统、荧光标记技术、双通道荧光扫描技术和数据分析软件，是第一次真正意义上的用DNA芯片技术进行基因表达分析的应用。 部分基因组被测序的微生物全基因的DNA芯片问世，如：酿酒酵母，大肠杆菌。 人类、大鼠和小鼠的全基因组芯片。,生物芯片的发展历史和趋势（2）,生物芯片的发展方向主要有：无标记杂交信号检测；高度自动化的杂交流水作业系统；强大的数据处理软件。,生物芯片发展的最终目标：是将样品制备、生化反应到检测的整个分析过程集成化，以获得所
8、谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室（Lab-on-a-chip)。,蛋白芯片： 90年代初期报道的微斑免疫分析法中，所有抗体圆斑的直径只有10 m，并用了激光共聚焦显微镜来检测标记抗体的荧光。 2001年Zhu等人，克隆了酵母菌中编码蛋白质的5800个开放阅读框，在载体中表达出了各自的编码蛋白，并把这些蛋白印制到聚二甲基硅氧烷（PDMS)上，制成高密度的酵母蛋白组微阵列。 Clontech公司推出500个抗体的抗体芯片。 其他的芯片： 如芯片毛细管电泳、PCR反应芯片、介电电泳芯片等。,生物芯片,药物机理研究,功能基因组研究,农林业,药靶发现,突变检测,军事、司法,疾病分子诊断,生物芯片技术
9、的应用领域,药物筛选,药物开发,基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。,第二部分 基因芯片,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,基因芯片发展过程,cDNA clones (target),PCR product amplification purification,printi
10、ng,microarray,Hybridise target to microarray,mRNAprobe),excitation,laser 1,laser 2,emission,scanning,analysis,overlay images and normalise,0.1nl/spot,二、基因芯片的制备,基因芯片的制作方法,原位合成 点样,光蚀保护 Affymetrix Ink-jet Agilent Digital Micromirror Device NimbleGen 分子印章 东南大学,cDNA PCR 产物 Oligo 其它形式的基因产物,已有的微阵列制备技术,主要微阵
11、列供应商,最多可达19200个点,接触式点样 非接触式点样,三、基因芯片的使用（1）样品的种类、处理和纯化,新鲜的组织样本，细胞，FFPE组织，显微切割组织等,基因芯片的使用（2）RNA的质量检测,28S,18S,28S:18S2.0,在0.5-2.0 Kb之间,Total RNA,mRNA,基因芯片的应用（3）杂交实验条件,样品的标记 标记方法 DNA：PCR，随机引物，缺口翻译。 RNA：逆转录，线性放大。 标记物 同位素 荧光染料(Cy3, Cy5) 化学发光,芯片杂交 杂交体积(使核酸浓度增加 10万倍） 玻片: 2-200l 滤膜：5-50ml 杂交液和杂交液的组份( 杂交温度、时间
12、 芯片的洗涤 洗涤液的组成 洗涤的温度、时间,基因芯片的应用（4）检测方法,激光共聚焦扫描 光源：特定波长的光 激发面积：100平方微米 如：Agilent Scanner,CCD（电荷耦合器件）成像 光源：连续波长的光（如弧光灯） 激发面积：同时激发多个1平方厘米的面积,From chip to data,基因芯片的使用（5）芯片数据的处理和分析,基因芯片的数据解读和分析,芯片图像的处理。 芯片杂交后获得的数据与芯片的基因信息的连接。 芯片数据的预处理及数据的可视化。 数据处理和分析的算法。 数据分析方法对新功能、疾病诊断和治疗等进行预测。 芯片的数据与多种资源和信息建立有效连结。,芯片图像
13、的处理,芯片的图像信息存储在16位的Tiff图像里，每个点的强度都是根据在这个点位置的相应像素的强度值得到的。 图像处理的基本目的是得到芯片上样点的具体信息。 常用的芯片图像处理软件： Biodiscovery Inc. 的 ImaGene Imaging Research Inc. 的 ArrayVision Axon Instruments Inc. 的 GenePix Pro Packard Bioscience 的 QuantArray Stanford University 的 Scanalyse Media Cybernetic 的 ArrayPro Analyzer,下表是整理后
14、数据的一部分,芯片的基因信息,样点信息，包括Array ID, Clone ID, Probe ID 等。 对应的基因的序列信息或Probe序列。 基因的相关信息，包括GenBank ID, Unigene ID, Gene name, GO ontology, Pathway 等。 芯片制备的目的、条件、方法；样品的制备、杂交条件、环境条件和检测方法。,数据读取后的初步分析和可靠性评估,1、阳性信号检出率：取阴性质控点如DMSO的信号值，分别计算其Cy3、Cy5信号平均值与2倍平均方差的和（mean+2*STDEV），Cy3、Cy5信号值分别大于这一值的基因点为检出点。 2、将一些质量很低，
15、数据可能不准确的点予以滤出。 3、对芯片数据进行标准化处理。 4、数据的分布：一般用散点图来表示。 5、重复性一般用R2来表示。,片内,片间,数据的预处理 芯片数据的质量（1）,芯片数据的质量包括两个方面：整个芯片的质量和芯片上点的质量。 评价整张芯片质量的最简单也是最常用的方法是计算整个芯片的信噪比。信噪比低表示整张芯片背景高，芯片的质量差。,数据的预处理 芯片数据的质量（2）,信号点的质量影响体现在5个方面 信号点的大小和规则度 信噪比 信号点周围的背景强度 信号点背景的均一程度 信号的饱和程度 一般在分析时，会先确定质量低的点，并滤除这些点，这是数据处理的重要步骤。,数据的预处理 数据的标准化（1）,影响芯片原始数据的因素很多，在对芯片数据分析之前，必须进行数据的标准化（normalization)。数据的标准化是要减少芯片在处理过程中技术（系统）因素的影响，使检测的结果能真实地反映生物功能地差别，芯片的数据只有经过标准化处理后才具有可比性。 Normalization方法有按参与校正的基因分： 全部基因参与 Housekeeping 基因参与 Reference 基因参与,数据的预处理 数据的校正（2）,按值的估计方法分有3种： 全局法（global method） 线性回归（linear regression） 局部加权最小二乘法 （LOWESS)
