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1、中华血液学杂志 2003年12月第24卷第12期 Chin J Hematol，December 2003，Vol 24. No.12转mdrl基因诱导CIK细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性杨永红 李惠芳 石永进 王逸群 张英 王奕嘉 朱平 摘要 目的 将多药耐药基因(mdr1)转入细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer，CIK)细胞，观察其是否产生耐药性并且保持肿瘤杀伤活性。方法 用IFN-，CD3单抗，IL-2，IL-1等细胞因子体外诱导外周血单个核细胞获得CIK细胞。采用电穿孔方法将mdr1基因表达质粒pHamdr，转入C细胞。转染后72h提取细胞总RNA，DNA酶
2、消化残留质粒DNA后进行RT-PCR，鉴定mdr1基冈表达；流式细胞仪检测细胞膜耐药蛋白(P-gp)表达。四唑蓝比色法(MTT)检测转基因后CIK细胞对阿霉素和秋水仙碱的耐药性；同时检测转染前后CIK细胞对MCF7细胞(人类乳腺癌细胞系)的杀伤活性变化。结果 转染mdr1后的CIK细胞mdr1 mRNA阳性，P-gp阳性的CIK细胞为2137(平均27)。转染后CIK细胞获得了多药耐药性，对阿霉素的IC50值较转染前升高了223458倍，对秋水仙碱的IC50值升高了671135倍。转染前后CIK细胞对MCF7肿瘤细胞的杀伤活性无明显变化(P 005)。结论 CIK细胞转入mdrl基因后获得了多
3、药耐药性，转染后的CIK细胞仍然保持原有的肿瘤细胞杀伤活性。 关键词 基因，mdr1； 抗药性，多药； 杀伤细胞，细胞因子诱导； 基因转染 CIK cells acquired multidrug resistance and maintained cytotoxic aetivity to tumor cells after mdrl gene transfection YalGYong-hong，LI Hui-fang，SHI Yong-jin，WANGYi-qun，ZHANGYing，WANG Yi-jia，ZHU Ping. Beijng Univensity Finst Hospit
4、al，Beijing 100034， China Abstract Objective To investigate whether the cytokine-induced kilier (CIK ) cells could acquire multidrug resistance and maintain the original cytotoxic activity after multidrug resistance (mdr1) genes transfection. Methods CIK cells were generated from peripheral blood cul
5、tured with IFN-，CD3 monoclonal antibody，IL-2，IL-1 and transfected with a plasmid (pHamdr) containing human mdrl gene via electroporation，RT-PCR method was used to assay mRNA expression of mdrl gene in transfectec CIK cells，flow cytometry with anti-P-gp monoclonal antibody to detect P-glycoprotein (P
6、-gp) expression on CIK cells membrane，and MTT assay to compare both the multidrug resistance to doxorubicin and colchicines and cytotoxic activity to human mammary cancel cell line MCF7 between transfected and non-transfected CIK cellsResult mdrl expressmn was detected in the transfected CIK cells.
7、There was a strong expression of P-gp on the transfected CIK cells and the percentages of P-gp positive cells were 2137(average 27). The IC50 of transfected CIKcells to doxorubicin was 223458 times and 67 1135 times to colchicines of those of non-transtbcted CIK cellsThe cytotoxic activity to MCF7 r
8、emained unchanged(P005)Conclusion It demonstrated that CIK cells transfected with mdrl gene via electroporation could express multidrug resistance successfully without changes of cytotoxic activity Keywords Gene，mdrl； Multidrug resistance； Killer cells，cytokine-induced； Gene transfection 细胞免疫治疗是肿瘤治疗
9、中一种重要的辅助治疗方法，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞因其可体外大量扩增，细胞毒活性强，不良反应少而倍受关注。临床应用时已观察到，在微量残留病期将CIK细胞输注患者体内，可以减少肿瘤的复发，甚至有希望彻底治愈肿瘤。但是由于肿瘤细胞并不能在几个疗程的化疗中完全被杀灭，而CIK细胞本身又对化疗药物敏感，不可能同时进行化疗和CIK细胞免疫治疗，大大限制了CIK细胞的应用。如果能将多药耐药基因转入CIK细胞使其产生耐药性同时保持其杀伤肿瘤细胞活性，则有可能解决这个问题。我们应用电穿孔方法将mdrl基因转入CIK细胞，观察转基因对其产生耐药性以及对肿瘤细胞杀伤活性的影响。材料和方法 1 制备CIK细
10、胞1 经CS-3000 (Baxter公司产品) 血细胞分离机初步采集5例淋巴瘤患者外周血单个核细胞(PBMNC)，再用Ficoll液分离，经PBS洗涤3次后培养于含10胎牛血清的RPMl 1640(GibcoBRL公司产品)培养基中，细胞密度1X106ml，第一天培养加入IFN-1 000Uml，24h后加入IL-2 1000 Uml，CD3单抗50ngml及IL-1 500Uml (以上均为终浓度)，每3d更换培养液一次并补加IL-2，浓度同前；培养13d后收集CIK细胞待用。用抗CDB、CD56单抗采用流式细胞仪对细胞表型进行鉴定。 2 mdrl基因转染ClK细胞 质粒pHamdr由美国
11、Gottesman博士惠赠，mdrl基因全长cDNA 4 400bp，来自人类多药耐药KB细胞系。收集对数生长期CIK细胞，细胞计数后用无血清RPMI 1640制成1X107ml的单细胞悬液，并按40gml加入质粒pHamdr，选择间隙为4mm的电转杯，电压280V，脉冲宽度20ms，单脉冲，应用方波电穿孔仪(BTX公司产品，ECM830型)进行基因转染(电穿孔后细胞的死亡率为2942，平均为36)。转染后细胞子含10胎牛血清的RPMl 1640培养液中继续培养，细胞密度为5X106ml，并按500Uml加入IL-2。实验设立对照组以空质粒(pcDNA30)代替目的质粒 (pHamdr)进行基
12、因转染，方法同上。转染后CIK细胞经锥虫蓝染色计数细胞死亡率。 3 mRNA水平检测，RT-PCR扩增目的基因片段 应用TRIzol试剂盒(GibcoBRL公司产品)提取CIK细胞总RNA，DNA酶消化可能残留的质粒DNA后，应用随机引物和反转录酶试剂盒(Promega公司产品)反转录合成cDNA第一链。PCR总反应体系体积为25l，其中含扩增耐药基因的上下游引物各10pmol，dNTP(含dATP，dCTP，dGTP，dTIP)01 mmolL，1 U Taq聚合酶和3l的cDNA产物，1XPCR缓冲液10mmolL Tris-HCl (pH 83)，50mmolL KCl，15 mmolL
13、 MgCl2，及01Triton-X100)。PCR扩增条件：94预变性5min；94变性30s，55 退火30s，72延伸30s，共25个循环；720C延伸10min，反应结束后产物于4保存。PCR产物用60gL聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染鉴定。mdrl上游引物序列为：5-CATYGGTGTGGTGAGTCAGG-3，下游引物序列为：5ACAGAAAGCGAAGCAGTGGT-3，目的片段长度为300bp。同时扩增F-actin作为检测cDNA的指标，上游引物序列为5ATCTGGCACCACACCTYC 3，下游引物序列为：5，AGCCAGGTCCAGACGCA-3，目的片段长度为291bp。引
14、物由博雅公司合成。 4 流式细胞仪检测CIK细胞P-gp的表达 转染后 72h收获CIK细胞制成单细胞悬液，PBS液洗涤2遍后加入小鼠抗P-gp单克隆抗体(JSB-1克隆系，阴性对照组用无关抗体代替)4 避光反应45 min， PBS洗涤2遍，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，4避光反应30min，PBS液充分洗涤后用1多聚甲醛固定，应用流式细胞仪(美国BD公司，FACSort型)检测细胞结合的抗体荧光强度，激发波长为488nm，经Cell Quest软件处理获得Log荧光直方图，并得出荧光阳性细胞百分比。以上所用抗体购自北京中山生物公司。 5 四唑蓝比色法(MTT)检测CIK细胞对阿霉素和
15、秋水仙碱的耐药性 分别将转染前及转染后的CIK细胞用含10胎牛血清的RPMI 1640培养液制成2 X106ml单细胞悬液，接种于96孔培养板中，100l孔，加入五种不同浓度(10-4100 mgm1)的阿霉素 (Sigma公司产品)或不同浓度(10-510-1gml)的秋水仙碱(Sigma公司产品)，每种浓度设立4个重复孔，转染前和转染后对照进行，此外还设立空白对照组和转染前、转染后未用药组。培养72h后加入5 mgml的MTT(Sigma公司产品)10l/孔，继续培养4 h后1 000rmin离心10min，去上清，加入二甲基亚矾(DMSO)200l/孔，振荡10min，使蓝色结晶物充分溶解后用ELISA检测仪测定吸光度(A，波长570nm)值，计算细胞生存率，药物杀伤率及半数抑制浓度(IC50)2，比较转染前后CIK细胞的耐药性。 6 MTT检测转染前后CIK细胞对MCF7细胞的杀伤活性3 本实验室保存的人乳腺癌肿瘤细胞系 MCF7常规复苏后培养在含10胎牛血清的 RPMI l640培养液中，应用对数生长期的细胞作为靶细胞，按2X105ml接种于96孔培养板中，100l孔，CIK细胞按效靶细胞比(E：T)为5：1，1：1，1：5分为3组接种，每组设立8个重复孔，另外同时设立空白对照组，相应细胞密度的转染前、后CIK细胞和 MCF7细胞培养组。培养24h后离心去
