王勇代谢工程研究生课程

《王勇代谢工程研究生课程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《王勇代谢工程研究生课程（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、代谢工程,一、代谢工程的产生及沿革 二、代谢工程的理论基础 三、代谢工程的研究概要 四、代谢工程的研究技术与工具 五、代谢工程的研究策略 六、代谢工程的重要应用和发展前景,一、代谢工程的产生及沿革,1 半个多世纪微生物生理与育种知识的累积 2 基因工程理论和技术的成熟 3 代谢流定量分析技术的发展 4 生化工程在线检测和建模方法的发展,微生物生理学、遗传育种学和生物化学的发展，使得人类可以用代谢途径操作的手段来改造微生物以获得期望的性质，如在氨基酸（谷氨酸）、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到采用这个路子实现人类理想的一些突出的例子。至此，代谢控制发酵得以出现和发展。,1 半个多世

2、纪微生物生理与育种知识的累积,这些方法主要依赖于用化学诱变剂处理微生物，并用进行设计的筛选技术来检出已获得优良性状的突变株。尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但人们对突变株的遗传和代谢性状的精确变化，知之甚少。,尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定向的含义，但传统的诱变是随机的。“定向”与随机诱变没有直接关系。 但我们早就根据随机诱变后从突变株中筛得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制的机制。,6,基因工程的理论和DNA重组的分子生物学技术已成熟。DNA重组的分子生物学技术的开发和应用，把代谢操作引进了一个新的层面，人们已能对代谢途径的指定酶

3、反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。,2 基因工程理论和技术的成熟,代谢流量分析（ metabolic flux analysis）是一种研究胞内代谢的方法，根据已有的代谢网络的信息建立胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡，以实际测得的分泌到胞外的代谢中间产物的浓度，来推算代谢流量。,3 代谢流量分析技术的发展,这种分析方法的基础是拟稳态假设，即假设在产物形成速率最大的阶段各种代谢中间物的胞内浓度变化速率为零。根据质量平衡，由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的浓度，计算未知途径的流量。,3 代谢流定量分析技术的发展,色谱、

4、质谱、红外等在线检测手段，以及生物传感技术的发展，可为发酵在线检测和反馈提供可靠的原始数据。建模方法也有发展。,4 生化工程在线检测和建模方法的发展,代谢工程重要事件纪录,代谢控制发酵得以出现和发展、基因工程理论和技术的成熟、代谢流定量分析技术的发展、生化工程在线检测和建模方法的发展最终使得代谢工程学科的建立和发展。,二、代谢工程的理论基础,（一）基本概念 （二）代谢工程要解决的问题 （三）代谢工程的研究对象、目标与依据 （四）代谢工程的实质 （五）代谢工程理论涉及的内容,一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。,生化反应途径和代谢途径,生化反应途

5、径按生物化学规律汇成生化反应网络；代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。,生化反应网络和代谢网络,代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”。所谓“联网”就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立联系。“联网”可以用化学或生物学方法（ 含DNA重组技术 ）来实现。 广义的 “联网” 包含代谢网络细节不同的生命有机体之间接力赛式的代谢联系。已在“网” 上或者可以“联网” 的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。,代谢网络的联网问题,代谢物在代谢网络中流动形成代谢流。广义的代谢流还包括能量

6、流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。,代谢流和碳架物质流,在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。,代谢主流,从字面上讲，有代谢物流通过的代谢途径即载流途径。载流路径是工业发酵领域的术语。在工业发酵的目的产物生产阶段，碳架物质从原料到目的产物流经的各段代谢途径（即载流途径），按流经的先后次序首尾衔接，组合成载流路径。代谢工程没有必要研究所有的载流途径，但必须研究载流路径上的代谢流，也就是生产阶段的代谢主流。,载流途径与载流路径,微生物的代谢主流的方向、流量甚

7、至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络中的途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。,代谢主流的变动性和选择性,为了提高产物对原料的转化率，就要求代谢主流（根据代谢分析的结果）经设定的载流路径流到目的产物。因为这样的载流路径是带有主观导向性的虚拟的载流途径，所以把它们叫做理想载流路径。,理想载流路径,既然微生物的代谢主流对网络中的途径有自主的选择性，而工业发酵的目标又是要微生物的代谢主流经理想载流途径流到目的产物，因此就有必要去解决理想载流途径的设计问题和对代谢主流的合理导向问题。,微生物生物工程

8、的难题,在工业发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质（一般要经胞外酶降解后）从培养介质跨膜进入细胞，（一般要）经过“向心途径”、“中心途径”和“离心途径”等三段连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质。,代谢的“五段式”,因此，典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条载流途径上流动的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流的“五段式”。,代谢的“五段式”,在“载流路径” 、“代谢主流” 和“五段式” 等概念的基础上，从统筹的角度出发，提出能作为一个整体

9、用于设计育种以及发酵工艺控制的五字策略： “ 进、通、节、堵、出 ”。,工业发酵的五字策略,进，促进细胞对碳源营养物质的吸收； 通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物； 节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物； 堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径； 出，促进目的产物向胞外空间分泌。,工业发酵的五字策略,微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）叫做节点（node），微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用 “五字策略” 制订育种方案时必须认真考

10、虑节点刚性问题，尽量采用解除调节的育种手段。,代谢网络的节点及其刚性,微生物自动抵制代谢网络中代谢物流量分布的改变的特性叫做代谢网络的刚性。代谢网络的刚性与主要刚性节点的刚性大小、分布及数量密切相关。,代谢网络的刚性,把量化代谢流及其控制的工程分析方法与根据分析结果制定的遗传修饰方案付之实施的分子生物学技术结合起来，以反复分析、校验和修正的方式进行实际操作，改善微生物的产物形成的能力和微生物的细胞性能，从而满足人类对生物的特定需求的生物工程的分支。,代谢工程（定义）,（二）代谢工程要解决的问题,要解决的问题就是改变代谢途径中的物质流向，或者改变物质流在不同途径中的流量分布。,（三）代谢工程的研

11、究对象、目标与依据,研究对象：代谢网络； 目标：修饰代谢过程将代谢物质流导入目的代谢产物的载流途径，以获得产物的最大转化率； 主要依据：对代谢节点的判断。,（四）代谢工程的实质,对物质代谢的方向、流量及控制进行定量分析，并在此基础上进行代谢过程改造，最大限度的提高目的代谢产物的产率。与传统的诱变育种技术不同，它是一种有目的、有理性的改造，涉及生理学、分在生物学、生物化学等多门学科。,（五）代谢工程理论涉及的内容,涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理；它提供了生物体基本的代谢图谱和生化反应的分子机理。 涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理；这是代谢途

12、径修饰的理论依据。,涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、变构抑制效应、修饰激活效应等。 涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理；他们阐明了基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套技术。,（五）代谢工程理论涉及的内容,（五）代谢工程理论涉及的内容,涉及细胞生理状态平衡的细胞生物学原理。它为细胞代谢机能提供一个全景式的描述，是代谢速率和生理状态表征研究的理想平台。 涉及发酵或细胞培养的工艺和流程控制的生化工程和化学工程的原理。 涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理。,代谢工程与所有传统的工程领域一样，代谢工程也包含 “分析” 和 “综合” 两个规定的

13、步骤。,三、代谢工程的研究概要,三、代谢工程的研究概要,但是，因为代谢工程借助于DNA重组技术而作为一种实用技术出现，所以一开始人们就把注意力放在这个领域的综合方面：新的基因在不同寄主中的表达，胞内酶的扩增，基因的删除，酶活力修饰，转录的解调或酶的解调等。,这样所谓的代谢工程，在相当程度上仅仅是应用分子生物学技术表现形式，因此从生物过程的角度来衡量，并不是够格的代谢工程。而有关工程的内容，只是反应在代谢工程的分析部分。,三、代谢工程的研究概要,三、代谢工程的研究概要,代谢工程的一个基本目标是阐明代谢流控制的因素和机制，而系统研究代谢流及其控制机制有三大基本步骤： 第一，建立一种尽可能多的观察途

14、径并测定其流量的方法； 第二，在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统达到新的稳态时的代谢途径； 第三，系统分析代谢流的结果。,四、代谢工程的研究技术与工具,代谢工程的多学科性质决定了它的发展优势，同时也暗示了它在研究方法和技术方面的综合性，主要可归为三类： 第一，检测技术。 第二，分析技术。 第三，操作技术。,检测技术,常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如同位素示踪确定代谢流的物料平衡；还有表征酶反应进程的酶动力学分析方法；测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量的光谱学方法，如核磁共振。根据这些测量信息可以判断和描述体内代谢流的基本状态，并为细胞代谢流及其控制分析提供翔

15、实可靠的原始数据。,分析技术 在获得大量生化反应基本数据基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法，并结和计算机技术可以进一步阐明细胞代谢途径和代谢网络的动态特征与控制机理，同时确定途径改造的关键靶点。这些手段包括测定细胞内代谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂网络分析的组合法，即时生化反应甚至基因表达调控定量化的计量法等。,操作技术 代谢工程中，代谢途径和代谢网络的操作实质上可以归纳为基因水平上的操作。这个过程几乎涉及所有的分子生物学和分子遗传学专门试验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控；DNA的杂交检测与序列分析等。,四、代谢工程的研究技术与工具,研究工

16、具 分子生物学工具：几乎所有基因工程工具和技术都是代谢工程所必需的； 分析化学和测量工具：经典研究代谢途径的技术，如质量平衡、阻断突变株分析等是必需的，无损伤即时分析（核磁共振）、流式细胞计量署等越来越重要；,研究工具 数学和计算机工具：现有的数学和计算机工具大部分都与代谢工程的信息控制和系统分析有关，代谢工程需要微生物遗传和生理信息，DNA数据库和计算机分析程序现已可获得。,四、代谢工程的研究技术与工具,五、代谢工程的研究策略,目前，代谢工程战略思想主要有以下几方面： （一）在现存途径中提高目标产物的代谢流； （二）在现存途径中改变物质流的性质； （三）利用已有途经构建新的代谢旁路。,（一）在现存途径中提高目标产物的代谢流,1 增加代谢途径中限速步骤酶编码基因的拷贝数； 2 改造以启动子为主的关键基因的表达系统，强化其表达； 3 提高目标途径激活因子的合成速率； 4 灭活目标途径抑制因子的编码基因； 5 阻断与目标途径相竞争的代谢途径。,（二）在现存途径中改变物质流的性质,1 利用某些代谢途径中酶对底物的相对专一性，投入非理想型初始底物（如结