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1、核酸提取 及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.,DNA提取及常见问题分析 RNA提取及常见问题分析,讲座内容,DNA提取 及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.,DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析,DNA提取及常见问题分析,保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等,DNA提取的原则,基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法,DNA提取的方法,基因组DNA提取主
2、要方法,CTAB法 适用于植物组织，真菌等 SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等,CTAB法(植物DNA提取经典法),原理 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HC
3、l （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,
4、离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,植物基因组DNA提取试剂盒,缓冲液GP1 缓冲液GP2 去蛋白液GD 洗脱缓冲液TE 吸附柱CB2(20g) 收集管,每个离心柱处理 材料的量为 鲜重：100mg 干重：30mg,SDS法,原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA,SDS提取缓冲液的配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环
5、境，使DNP充分溶解，存在于液相中； SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,动物组织细胞,裂解液,上层溶液,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,组织匀浆,SDS法流程图,细菌基因组DNA提取试剂盒 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 病毒基因组提取试剂盒 酵母基因组DNA提取试剂盒 CB2：20 (g),SDS提取试剂盒,细菌基因组DNA提取试剂盒 15ml细菌菌液/离心柱 10-40 g 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 全血 100 l1ml 3-30 g 动物细胞培养液 106107cells 5-30g 动物组织 30mg 10-30g 病毒基因组
6、提取试剂盒 DNA RNA 酵母基因组DNA提取试剂盒 Lyticase(20U/ g）,不同材料对SDS提取试剂盒提取量,96血液基因组DNA试剂盒 一次实验可提取96个样品，快捷、方便。,不同材料对SDS提取试剂盒提取量,基因组DNA其它裂解方法,根据细胞裂解方式的不同有： 物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解 生物方式：酶法,基因组DNA纯化的方法,吸附材料结合法：,硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒,质粒DNA提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.,碱裂解法 煮沸法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多
7、，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,上层溶液,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,质粒DNA溶液,离心柱型 质粒DNA提取试剂盒,96系列,细胞器DNA提取,TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.,细胞器DNA,线粒
8、体 叶绿体,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,基因组DNA 新鲜材料，低温保存 血液基因组DNA提取选择有核细胞 细胞培养时间不能过长 含病毒的液体材料提取前先富集,质粒DNA 对数期的菌体 培养时应加入筛选压力 低拷贝或大质粒，应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,基因组DNA 材料过多影响
9、裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细 菌溶菌酶破壁 酵 母破壁酶或玻璃珠,质粒DNA 菌体量适当，除净培养基 变性的时间不要过长（5分钟） 控制复性时间，避免基因组DNA的污染 G菌、酵母细胞酶或机械处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系 采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,材料准备,细胞裂解,核
10、酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等） 蛋白酶处理,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,多糖的去除： 多糖水解酶 在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,多酚的去除： 加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏
11、糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,DNA提取基本步骤,预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀 加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀 晾干DNA，让乙醇充分挥发,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA提取基本步骤,问题一：DNA降解,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老 提取操作过于剧烈，DNA被打断 外源核酸酶污染,低温保存，避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织，应在
12、解冻前加入裂解缓冲液 增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后操作应尽量轻柔 试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融,问题二： DNA样品不纯,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于
13、动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,RNA提取 及常见问题分析,TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO., LTD.,RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析,107 个细胞 10g 30mg动物组织， 30-100mg植物组织 rRNA 占8085 mRNA占1-5%,AAAAAA,细胞中RNA的含量,mRNA的应用,RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸
14、反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNA Microinjection),RNA的不稳定性,内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC） 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍 目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。,RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合，使其失活 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形
15、成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性 SDS、尿素、硅藻土等,常用的RNA酶抑制剂,RNAsafe,RNA酶抑制剂,提取RNA的注意事项,经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在180烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染,RNA提取相关知识及注意事项 RNA提取方法 RNA提取常见问题分析,异硫氰酸胍/苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,
16、动植物材料,研磨或匀浆,细胞裂解,基因组DNA,水相,有机相,RNA,氯仿,纯化,pH5.7,离心,加入裂解液(TRNzol),RNA提取流程示意图,等体积异丙醇沉淀,70乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相 RNA,传统方法：有机溶剂抽提，得率高,柱纯化法：纯度高，无有机溶剂,RNA提取流程示意图,可选择的RNA提取产品,材料准备,TRNzol裂解细胞,加入氯仿抽提,RNA沉淀 柱纯化,RNA溶解 保存,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位 培养细胞除尽培养液 消化系统的组织选取杂质少的部位 细菌和酵母需要破壁处理 样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存 液氮研磨时不要使
