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1、主讲人：刘立新 西安电子科技大学,生物光子学,1,第 5 章,生物光子学成像技术,2,5.1 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,3,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope， LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今
2、世界最先进的细胞生物学分析仪器，有细胞“CT”之称。 激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。 与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点。所以它问世以来在形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等研究领域中得到了广泛应用。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,4,4,全场和共焦荧光显微技术,在常规的全场显微镜中，整个样品都被光（汞灯、氙灯等光源）照射，可以用眼睛直接观察图像，或将图像成像到图像探测器如CC
3、D相机上。 在共焦显微镜中，用聚焦光（一般来自激光）沿着样品进行逐点扫描、照明和探测（用点探测器如PMT和APD），用计算机重构样品的图像。 用光束扫描的方法得到的图像是样品的一个光学切片。,,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,5,Wide-field Fluorescent Microscope,Confocal Microscope,6,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,LSCM原理示意图 Marvin Minsky (1950s) 基本原理：相干光（激光）通过与样品上扫描光点共轭（共焦）面上的一个针孔； 光束被DM反射到样品上，光点在某一个焦面上沿着样品扫描； 照明点发出的荧光 (同一焦面）
4、通过DM后被聚焦成一点，成像到探测器前的共焦针孔上； 焦面外的光不能到达PMT； PMT将聚焦光转换成模拟电信号（电压不同代表强度不同）； 通过移动显微镜的样品台，可以对不同的焦面进行扫描。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,7,Marvin Minskys patent picture,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,8,8,LSCM光路,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,9,9,全场显微图(a,b,c) 共焦显微图(d,e,f)，,,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,10,3D共焦与全场显微图比较,11,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,共聚焦光学切片3D重构图,减少由于焦面外光散射产生的图像模糊
5、（背景消除） 增加有效分辨率 控制景深，提高信噪比 厚样品光学切片的序列采集（Z轴切片扫描3D重建） 可以实现数字放大倍率的调节 活体样品成像 多色标记,共聚焦显微镜的优点,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,12,共焦显微扫描系统： 样品台扫描-扫描光束静止，载有样品的样品台移动 光束扫描-样品静止，光束移动 单光束 (cLSM): 速度慢 多光束(旋转盘): 速度快（几乎实时),1,2,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,13,序列数据采集 光学切片 图像特征 应用,图像采集的速度 逐点重构图像,x-y扫描和z切片 缩放因子,点扩展函数 (PSF) 动态范围,3D-图像重建 4D-时序成像,5.4
6、 激光扫描共聚焦显微技术,14,14,序列数据采集：图像采集速度,扫描意味着每一层的图像通过序列取样来进行构建，用移动光束扫描样品，与全场方法相比有一些缺点：,全场显微镜 同时获取整个图像 更适用于活细胞或运动细胞,共焦显微镜 逐个照明各个区域，直至整个视野被取样-图像采集速度慢 活细胞，运动细胞Nipkow disk-type system,与计算机图像存贮技术兼容，在细胞或组织内产生高空间分辨数字化数据集，反映标记物的三维分布，或细胞的层析成像。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,15,15,目的是用尽可能小的聚焦光点在焦面上照明样品。 将准直的平面波从后方送入物镜，被物镜变成汇聚的球面波，
7、形成衍射受限激发光点。 这样，利用了物镜的最大数值孔径NA，将光聚焦成非常小的光点。 照明光点沿着样品做两维栅扫描，将照明点的光信号按照对应位置和亮度显示在监视器上。 逐点构成样品的图像。,序列数据采集：逐点构建图像,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,16,16,光束扫描,聚焦光束在样品表面做横向的 (x-y平面)栅扫描，利用检流计马达驱动两面镜子的振动来进行光束扫描，产生扫描图案。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,17,17,2D 图像：x-y扫描,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,18,18,光学切片：Z切片和样品的3-D重建,在共焦图像中没有非焦面的光的干扰，因此可以对完整的固定或活体样品进
8、行直接的非侵入序列光学切片观察-对透明样品如细胞和组织进行3-D成像。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,19,19,花粉粒的3-D重建,尽管只显示了序列采集的36幅图像中的12幅，但是这些图像代表了相距为大约3m的不同焦面，显示了花粉颗粒内部结构。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,20,20,全场成像和共聚焦,全场成像,共聚焦,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,21,21,实际的样品不是点源，而是由无穷多的小于系统分辨率的物体组成的。,图像特征：点扩展函数 （PSF 和爱里斑）,某一点的荧光团被激发后， 荧光团向空间各个方向发射荧光 部分荧光被聚焦，形成一个爱里斑，中间亮，周围有明暗相间并依次递
9、减的图案。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,22,22,PSF (x,y,z)基于样品空间无限小的一点的光发射,当收集到样品三维图像时，就得到每一点的完整的点扩展函数。点扩展函数描述了样品中每一点发出的光经过光学成像系统后的变化情况。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,23,23,图像 离散阵列 关于亮度或色调的详细信息 精确的位置信息，详细的数值信息,图像特征：将连续图像变成数字形式,包含强度信息的小的矩形块组成的两维阵列像素,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,24,24,图像特征：将连续图像变成数字形式,为了将连续图像转变成数字形式，采用两个分别被称为取样和量化的过程，将模拟图像被分成独立的亮
10、度值 。,Sample area 100x100 m,Image area is 512x512 pixels,Pixel size (m)=100/512,取样间隔,在显微镜中，那些小于数字抽样间隔的结构在数字图像上无法表示出来- Nyquist取样定理或标准,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,25,25,图像特征：取样,如果在取样过程中像素数太少，那么，所有组成样品的空间细节将在图像中无法表示出来。 如果取样像素数过多，那么也不能得到额外的空间信息，这时认为对样品过取样。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,26,26,缩放因子,优点：不需要更换物镜，而通过改变激光扫描的区域来实现采用电子方式改
11、变放大倍率,缩放因子 通过减小扫描角度来减小扫描区域 减小像素尺寸 改善分辨率,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,27,27,应用,3D重建 沿着Z方向采集一系列2D 图像，从而重构出3D图像 4D成像：时序采集 在不同时间采集 Z-序列图像，得到4D数据，包括三维空间 (x, y,z)和一维时间（第四维），采用4D可视化软件进行观察。,5.4 激光扫描共聚焦显微技术,28,28,参考资料：高分辨率激光共焦显微成像技术新进展http:/ 光学成像 5.2 光学显微技术 5.3 荧光显微技术 5.4 激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术 5.7 荧光
12、共振能量转移成像技术 5.8 荧光寿命成像显微技术 5.9 光学相干层析成像技术 5.10 非线性光学成像技术 5.11 生物光子学成像技术的发展趋势,本 章 内 容,29,荧光显微成像,原理：激发荧光本质上是受激吸收和自发辐射的过程，组织吸收高能量的光子，电子跃迁到激发态，然后跃迁回低能态（不一定是基态，有可能是较低能量水平的激发态），并自发辐射光子（荧光）。 荧光显微像信噪比高，能够区分非常低浓度的生色团的空间分布。 主要有单光子荧光成像和双光子荧光成像。,5.5 多光子激发荧光显微技术,30,单光子荧光显微成像,单光子激发中，荧光分子每吸收一个照明光子，从基态跃迁到激发态，经过能量弛豫后
13、释放一个波长比激发光子波长长的荧光光子。单光子荧光在深层组织细胞会发生光子扩散，导致图像背景模糊不清。,5.5 多光子激发荧光显微技术,31,5.5 多光子激发荧光显微技术,双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理：在高光子密度的情况下，荧光分子同时(10-16s)吸收两个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子。,双光子荧光显微成像,32,光源要求： 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度
14、只有 100 fs，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。,双光子荧光显微成像,5.5 多光子激发荧光显微技术,33,多光子的优点： 减小光谱串扰； 不用共焦针孔实现固有的三维分辨； 长波长光成像深度深； 不采用UV光学器件对UV染料成像； 在焦点外区域的光漂白和光损伤小。,多光子的缺点（与共焦相比） 操作复杂 系统昂贵,5.5 多光子激发荧光显微技术,34,比较单光子荧光和双光子荧光： 1）在单光子激发状态下，发射波长大于激
15、发波长，荧光发射率与激发强度成正比，结果荧光在整个激发路径上产生。 2）在双光子激发过程中，利用波长更长的激发光激发，荧光由同时吸收的两个光子产生，这样荧光强度与激发光强度的平方成比例。 3）单光子激发只适用于对样品表面进行成像; 双光子激发能够对样品表面以下几百微米的深度进行成像。,5.5 多光子激发荧光显微技术,35,双光子荧光显微装置,5.5 多光子激发荧光显微技术,36,5.5 多光子激发荧光显微技术,37,5.5 多光子激发荧光显微技术,解扫探测，Descanned Detection (DDD),非解扫探测，Non-Descanned Detection (NDD),扫描光路,38
16、,38,光漂白,39,5.5 多光子激发荧光显微技术,39,吸收截面大，Stokes红移大,40,5.5 多光子激发荧光显微技术,40,活体神经元细胞双光子成像,41,5.5 多光子激发荧光显微技术,41,老鼠肾脏细胞的多通道双光子荧光图像,MPFM应用,42,5.5 多光子激发荧光显微技术,42,利用双光子激光扫描显微测量细胞质中的GSH水平,Gutirrez-Alcal G et al. PNAS 2000;97:11108-11113,MPFM应用,43,5.5 多光子激发荧光显微技术,43,MPFM应用,44,5.5 多光子激发荧光显微技术,44,MPFM应用-活体肺部组织,45,5.5 多光子激发荧光显微技术,45,MPFM应用-蕃红精染色的斑马鱼,5.5 多光子激发荧光显微技术,46,46
