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1、MALDI-TOF的样品制备的样品制备 ? 样品制备样品制备 ? 基质选择基质选择 ? 样品净化样品净化 样品制备的一般顺序：样品制备的一般顺序： 选择基质 制备基质溶液 混匀基质和样品 选择基质 制备基质溶液 混匀基质和样品 制备样品溶液 点靶 放干 制备样品溶液 点靶 放干 100 pmol/l多聚物多聚物 10 -100 pmol/l核酸核酸 0.1 - 10 pmol/l (糖蛋白糖蛋白 10 pmol/l) 多肽和蛋白质 理想浓度样品类型 多肽和蛋白质 理想浓度样品类型 理想的样品浓度理想的样品浓度 注注: 1 pmol/ul = 10-6M 常见的样品制备方法常见的样品制备方法 ?
2、干燥液滴法 ?真空干燥法 ?压碎结晶法 ?快速蒸发法 ?双层法 ?夹心法 ?电喷雾法 ?快速点样法 ?预点基质法 ?先点样品法 ?压片法 干燥液滴法干燥液滴法 操作步骤：操作步骤： 在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液 离心,吸取 5-10 uL 基质溶液上清,加到小离心管中 加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀 吸取 0.5-2 uL 点靶 室温自然干燥 本法最为常用，适用于大多数情况。 干燥液滴法的优缺点干燥液滴法的优缺点 优点优点 1.方法简单，适用于很多种样品 2.具有较好的耐盐性 3.适用于混合物 4.可以洗去表面的不挥发性盐份 缺点缺点 1.使用某些基质（如2,
3、5-dihydroxybenzoic acid ）时， 结晶不均匀，容易长在液滴的外环边上。 2.有些组份与基质不能形成共结晶。 真空干燥法真空干燥法 操作步骤：操作步骤： 在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液 离心,吸取 5-10 uL 基质溶液上清,加到小离心管中 加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀 吸取 0.5-2 uL 点靶 把靶放入真空干燥器内，抽真空到10-2Torr以下，使溶液快 速干燥 注：本法是干燥液滴法的一种变体。 真空干燥法的优缺点真空干燥法的优缺点 优点优点 ? 减小结晶颗粒的大小 ? 提高结晶的均匀程度 ? 提高质量准确度和分辨率 缺点缺点 ?
4、效果不总是好于干燥液滴法 ? 需要额外的真空泵 ? 碱金属离子加合峰较强 压碎结晶法压碎结晶法 操作步骤：操作步骤： 在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液 离心,吸1 uL基质溶液点到靶上，自然放干 取一块干净的玻璃片盖在基质晶体上按压 轻轻刷去多余的基质碎颗粒 吸取 5-10 uL 基质溶液上清,加到小离心管中 加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀 吸取 1 uL 混合液点到压碎的干燥基质上 室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不 挥发性溶剂 用吸水纸吸去多余水份，自然放干 注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品 压碎结晶法（简化
5、版）压碎结晶法（简化版） 操作步骤：操作步骤： 在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液 离心，吸1 uL基质溶液，用枪头在靶上涂刮，自然放干 吸取 5-10 uL 基质溶液上清,加到小离心管中 加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀 吸取 1 uL 混合液点到压碎的干燥基质上 室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不挥 发性溶剂 用吸水纸吸去多余水份，自然放干。 注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品 压碎结晶法的优缺点压碎结晶法的优缺点 优点优点 1.简单有效 2.对高浓度杂质有较好的容耐性 3.结晶更均匀，点与点之间的重现性更好 缺点
6、缺点 1.比较费时 2.难以高通量 3.吸取基质溶液时，要防止吸入未溶解的基质颗粒 快速蒸发法快速蒸发法 操作步骤：操作步骤： 在丙酮中加入1-2%的水或 0.1%TFA(v/v)，再加入基质， 使其浓度至半饱和（饱和至1/3饱和之间） 吸 0.5 uL基质点靶 吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干 除盐：吸5-10 uL 0.1% TFA加到样品点上 ，放置2-10秒 钟，吹去液滴 注：本法的分辨率和准确度最好 快速蒸发法的优缺点快速蒸发法的优缺点 优点优点 1.结晶均匀，颗粒小，无甜点效应 2.信号强度与浓度的相关性更好 3.灵敏度、分辨率和准确度更好 4.便于除盐 5.可批量预点
7、基质 (类似于PAC靶)，便于通量分析 缺点缺点 1.制样的重现性较差，点与点之间的重现性较差 2.对肽有效，但对蛋白的效果久佳 双层法双层法 操作步骤：操作步骤： 先配底层基质：用易挥发溶剂（如丙酮或甲醇）配制浓的基质 溶液 (5-50 mg/mL) 吸0.5 uL底层基质点靶，放干 再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强太 快）中配制新鲜的饱和基质溶液 离心,吸取 5-10 uL 基质溶液上清,加到小离心管中 加入1-2 uL样品溶液,涡旋混匀 吸取 0.5 uL 点在放干的基质颗粒上，放干 除盐：吸5-10 uL 0.1% TFA加到样品点上 ，放置2-10秒钟， 吹去液滴
8、 注：本法结合了压碎晶体法和快速蒸发法的特点，分辨率和准确度很好 双层法的特点双层法的特点 1.继承了快速蒸发法的优点，克服了其不足 2.提高了灵敏度和制样重现性 3.对于含有多肽和蛋白质的混合物很有效 夹心法夹心法 操作步骤：操作步骤： 在丙酮中加入1-2%的水或 0.1%TFA(v/v)，再加入基质，使 其浓度至半饱和（饱和至1/3饱和之间） 吸 0.5 uL基质点靶 吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干 再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强 太快）中配制新鲜的饱和基质溶液 吸1 uL上层基质溶液点在放干的样品点上，放干。 夹心法（改良版）夹心法（改良版） 操作步骤
9、：操作步骤： 在丙酮中加入3%体积的0.1%TFA，再加入基质至饱和 吸取10 ul该饱和溶液涂在AnchorChip靶的两排点上，立即 自然干 吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干 再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强 太快）中配制新鲜的饱和基质溶液 吸1 uL上层基质溶液点在放干的样品点上，放干 加5ul 10mM 柠檬酸氢二铵(含0.1%TFA)以除盐 。放置10秒 后吸干 加1 ul 重结晶溶液 (0.1g HCCA 溶解在1L乙醇:丙 酮:0.1%TFA (6:3:1)的混合液中)。 电喷雾法电喷雾法 操作步骤：操作步骤： 用毛细管吸取少量配好的样品与基质的混
10、合溶液 把毛细管固定在金属靶板的上方，管尖离靶板0.53 cm。 靶板接地,在毛细管上加 35 KV的电压，使溶液喷在靶板上。 注：样品分布均匀，结晶颗粒很小很匀。 电喷雾法的优缺点电喷雾法的优缺点 优点优点 1.制样均匀,重现性很好 2.信号强度与样品浓度的相关性很好 3.样品更耐激光的轰击 4.可以与毛细管电泳或液相色谱进行连接 缺点缺点 1.操作繁琐费时，每个样品约需5分钟，通量较低。 2.容易形成盐的加合物，需要脱盐 3.需要额外设备和培训 4.需要高电压，有一定危险 快速点样法快速点样法 操作步骤：操作步骤： ?吸1 uL样品点在靶上 ?立即再加1 uL基质溶液 ?用枪头在靶上混匀
11、?风干后,加2-5 uL 冷水进行靶上除盐 快速点样法的优缺点快速点样法的优缺点 优点优点 1.快速 2.适于蛋白的靶上酶解分析 3.便于在样品中加入内标 缺点缺点 1.条件不易控制 2.重现性较差 预点基质法预点基质法 操作步骤：操作步骤： 在靶上点好基质,放干备用 把样品溶液点在基质上 注: 本法快速,灵敏度高,可以与液相色谱或毛细管电泳相连进行在线点靶 先点样品法先点样品法 操作步骤：操作步骤： 先在AC靶上点样品(考染酶解液1ul ，银染酶解液3ul)。 放干后，再点1 ul 基质(0.4mg/ml HCCA溶于70%乙腈， 0.1%TFA)。 放干后，再点1 ul 0.1%TFA，放
12、置1分钟，吸干溶液。 注：适用于胶内酶解样品和AnchorChip靶 压片法压片法 操作步骤：操作步骤： 把样品与基质碾碎后混匀 在靶上压成片状 注:本法适用于无法溶解的样品 样品制备注意事项样品制备注意事项 ?样品应可溶于样品与基质的混合溶剂 ?在制样过程中,要小心溶剂挥发引起组成的变化 ?自然放干或风干,不要加热促干 ?基质溶液要现配 ?要尽量避免不挥发性溶剂,如甘油、PEG、Triton-X100、 DMSO和 DMF等 ?尽量对样品进行除杂纯化 ?必要时应进行样品的靶上脱盐及重结晶 ?在点靶前，避免样品与基质的混合溶液中出现未溶解的基质 ?晶体生长时，溶液的 pH值应小于4 ?在最终点
13、靶的溶液中，样品的终浓度应低于10 uM ?预先混匀法可以使混合物的分析重现性更好 ? 样品制备样品制备 ? 基质选择基质选择 ? 样品净化样品净化 基质选择指南基质选择指南: 根据样品的种类及性质根据样品的种类及性质 核酸核酸 多肽多肽/蛋白质蛋白质 多聚物多聚物 多糖多糖 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid HCCA广泛应用于多肽和小蛋白的分析，特别适用于多肽的一级和二级质 谱分析，是蛋白质鉴定的首选基质。 用CHCA测蛋白分子量时，容易形成带多个电荷的离子。 基质的重结晶纯化（当基质纯度不够时）基质的重结晶纯化（当基质纯度不够时） 在温乙醇中加入CHCA至溶解饱
14、和 过滤除去不溶物后，加入二倍体积的冷水，4C 静置24 hr以上。 过滤，沉淀用冷水清洗后晾干即可 CHCA/HCCA CHCA的制样方法的制样方法 干燥液滴法干燥液滴法 这是金属靶的标准制样方法 基质溶液: HCCA饱和于TA (ACN : 0.1% TFA, 1:2) 样品溶液: 多肽和蛋白在溶液中的浓度为10 fmol/ul-1 pmol/ul. 两溶液等体积混匀后，取0.5 ul 点靶。 薄层法薄层法 在板上点0.5 ul HCCA (在丙酮中饱和)基质，使成一薄层。 也可以在 基质溶液中加入1/5体积的硝基纤维素溶液 (20 g/l 溶于acetone/2- propanol 1:
15、1) 。 取0.5 ul 酸化的样品溶液(pH6，基质层 会被溶解） 放干 (如果怕样品氧化，可以进行真空干燥（真空度100 mbar） 用 5-10 ul 冷 0.1% TFA靶上脱盐2-3次 Sinapinic acid (SA) 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid SA适用于很多多肽和蛋白质，尤其是分子量较大的蛋白质 (10- 150 kDa)，也可用于一些极性多聚物的分析和蛋白质的源内裂解 分析，但对小肽(50 kDa 的蛋白质，可以用上层基质SA溶液(饱和于 ACN : 0.1 % TFA, 1:2)稀释样品。 先用干燥液滴法，也可以用压碎晶体法
16、 DHB DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid, gentisic acid) 2,5-DHB广泛应用于多肽、蛋白质、极性多聚物和多糖等的分 析，是磷酸肽和糖肽分析常用的基质，也可用于蛋白质的ISD分析 和脂类的分析。适用于AnchorChip 靶，不加有机相在水中即可 溶解。 缺点：结晶呈大的针状，不均匀，导致分辨率和准确度下降 DHB的制样方法的制样方法 干燥液滴法干燥液滴法 (用于多肽和蛋白质用于多肽和蛋白质) 将样品和基质溶液2,5-DHB (10 g/l in ACN : 0.1 % TFA , 1:2) 等体积 混匀后点靶 用SDHB 取代2,5-DHB，可减少大蛋白(50 kDa)的碎裂 用AnchorChip靶可避免甜点效应，并提高灵敏度 干燥液滴法干燥液滴法 (用于多糖用于多糖) 把样品溶液(10 pmol/ul in water) 和基质溶液 2,5-DHB (EtOH:H2O
