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1、第二章 生化实验基本技术第一节 离心分离技术离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由
2、于用途不同，故其主要结构也有差异。一、离心原理离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。(一)离心力和相对离心力离心力的单位为g，即重力加速度(980.6cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=rV21.11810或按下式计算所需的转速：。离心技术是根据微小
3、颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动，从而产生一个强大的辐射向外的离心力场，它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度，使之受到一个外向的离心力，其定义为： F = m2r式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力“ RCF”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场
4、中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”(980cm/S2)，此时“RCF”相对离心力可用下式计算：RCF = 1.11910-5(rpm)2 r ( rpm revolutions per minute每分钟转数，r/min )由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替： rav=( r minrmax)/2一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。计算颗粒的相
5、对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值(RCFa v)，即离心管中点的离心力。为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便。换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一
6、条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于rpm标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值，转数值处于rpm标尺左边，则应读取RCF标尺左边的数值。Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图，在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。将左侧r点与右侧n点连成一条直线，
7、与中间RCF相交的点即为相对离心力(g) RCF=1.118102rn2(二)沉降速度与沉降系数一个颗粒要沉降，它必须置换出位于它下方等体积的溶液，这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到，否则，在离心过程中颗粒将发生向上漂浮，而不是下沉。当颗粒在运动时，不论方向如何，它都要穿过溶剂分子，所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比，并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响，颗粒沉降速度与三方面的因素有关：1.颗粒本身的性质沉降速度与颗粒直径和密度成正比。密度相同时大颗粒比小颗粒沉降快； 大小相同时，密度大的颗粒比密度小的沉降快。2.介质的
8、性质沉降速度与介质的粘度、密度成反比，介质粘度、密度大，则颗粒沉降慢。3.离心条件颗粒沉降速度与离心时转速和旋转半径成正比。如果其他的条件不变，沉降速度随着r的增大而增大，在进行速度区带离心时，r对沉降速度的这种影响不利于达到满意的分离效果，所以需要在沿半径方向上相应地增加介质的密度和粘度以克服r的增加造成的影响。沉降系数(sedimentation coefficient)：为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度，它以svedberg单位计算，1S110-13 S。例如：核糖核酸酶A的沉降系数为18510-13 S。即可记作185S。当我们对某些生物高分子和亚细胞器组分的化学结
9、构、相对分子质量还不了解时，可以用沉降系数对它们的物理特性进行初步描述，将它们区分开来。例如大肠杆菌核蛋白体是70S，它由两个亚基组成，用超离心的方法测得其沉降系数分别为30S和50S，当我们还不清楚它们的结构时就暂以30S和50S命名以示区别。沉降系数S的值与颗粒的大小、形状和密度，以及离心所使用的介质的密度和粘度有关，而与转头的速度和类型无关。二、离心机分类常见的离心机有超速离心机(分析和制备用)、高速冷冻离心机、大容量冷冻离心机、连续离心机、一般用途低速离心机(无冷冻)以及台式(超速、高速、低速、特殊用途)离心机。在实际应用中，不同的离心机有不同的应用范围。1.低速离心机低速离心机的最大
10、额定转速一般为4000r/min，且连续可调。根据处理样品的容量大小，低速离心机可分为台式低速离心机、水平型桶式低速离心机和大容量立式低速离心机。台式低速离心机体积小，重量轻，能自动控制工作时间。操作简单。使用方便。适用于医院化验室、生物化学与分子生物学实验室进行定性分析；血浆、血清、尿素、疫苗制造等。大容量低速离心机往往用于样品的初级分离制备，还可直接用于瓶装、袋装样品的离心，为实验室大量样品的分离提供了条件。2.高速离心机高速离心机的最大额定转速为20000r/min左右，最大相对离心力可达到45000g，由于运转速度高，一般配备冷冻控温装置。高速离心机适用于各种生物细胞、病毒、血清蛋白等
11、有机物、无机物溶液，悬浮液及胶体溶液等样品的分离、浓缩、提取等制备工作，是细胞和分子水平研究的基本工具。高速离心机的速度控制系统和温度控制系统都优于低速离心机。如某些全自动高速冷冻离心机的速度控制系统采用IC电路，结构简单，性能稳定，且在IC速度自动控制电路内，专门设有超速保护电路，安全可靠，而温度控制系统则用SCR元件，通过两个热敏元件，检测离心室温度及环境温度，对离心室温度进行自动控制。由于高速离心机转速较高，离心力较大，对离心转头的强度要求也较高，多采用超硬铝、锻铝或不锈钢加工制成，且要经过满载超速爆炸试验，安全系数很高。高速离心机的离心管通常以塑料及聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯等制成。实际
12、工作中可按照不同的要求选择使用各种离心管。小容量台式高速离心机，机型轻小，操作方便，样品量小，离心力大，自动平衡，速度可调，性能稳定，安全可靠。可放在一般实验台、冷库、低温水箱中使用，适用于实验室小量样品液沉淀浓缩，是分子生物学实验中使用的基本设备。3.超速离心机超速离心机可分为分析用超速离心机和制备用超速离心机两种。制备用超速离心机最高额定转速在55000-83000r/min之间，最大相对离心力在6105g左右。超速离心机是医学、检验学、生物学、生物化学与分子生物学、化学、农业科学等研究领域的重要仪器之一。利用超速离心转头高速旋转所产生的巨大离心力可对细胞器、病毒、生物大分子进行分离、浓缩
13、、精制，并可用于测定蛋白质、核酸的相对分子质量等。超速离心机的运转速度高，产生的离心力场极强，对离心机的材料及各项质量要求极高。与制备用超速离心机相比，分析用超速离心机一般都装备有特殊设计的转头、控制系统和光学系统，可以直接观察了解和分析样品的沉降情况，能精确控制离心力，并且可用照相方法或者电子技术记录沉降粒子在离心过程中的行为。对这些记录进行分析，可以测定粒子的物理性质，如沉降系数、分子量、扩散系数、沉降物质的不均一性等。三、离心机的使用方法欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠，或颗粒太小能通过滤纸，总容量太少又需定量测定时，使用离心沉淀法比过滤要好。使用离心机前，应先检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机性能，检查套管与离心管大小是否相配，套管是否辅好软垫(用棉花或橡皮)。套管底部有无碎玻片或漏孔(碎玻片必须取出，漏孔须修补好)。检查合格后，每一对离心管放入一对套管中，然后连套管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对已平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的管必须放于对称位置。放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需的转速，达规定时间后，将转速旋钮逐步回零，待离心机停稳后，取出离心管。
