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1、实验九 质粒电泳 病毒的血凝和血凝抑制,原理,与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.08.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。,载样缓冲液,其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在点样孔底部，避免样品漂浮 其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯青）可以作为电泳速度度的指示分子，溴酚蓝的迁移位置大约相当于200 bp左右的线
2、性DNA分子的迁移位置。,溴化乙锭,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分子插入后，导致与DNA结合的染料呈现荧光，DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出来。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder,电泳准备,用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子
3、。 用1TAEbuffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1TAEbuffer)，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60，加入适量Goldview(或溴化乙锭)至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm之间。 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAEbuffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。,DNA电泳,取9l的DNA样品与1l的10*样品缓冲液（甘油，溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大小
4、、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。,质粒DNA,3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。 碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。,一 实验目的 1:学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作 3 ：理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用,病毒的血凝和血凝抑制,二 实验原理 1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些动物的红细
5、胞表面的相应受体结合，从而呈现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的,2:红细胞凝集抑制 当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑制。 3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫效果，或动物是否受到病毒感染 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验,4 红细胞的解脱现象 某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下来，因此
6、，血凝试验的时间太长，可能会在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实验过程中必须控制好时间。,三 实验操作 (一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集 37度培养72小时的鸡胚-放置于4度冰箱,致死鸡胚-消毒气室-用镊子打开气室-打开壳膜-用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管-5000转,离心5分钟,以去除细胞沉淀-上清液供血凝 和 血凝抑制试验作用. (三)制备1%浓度的鸡红细胞 采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓度.,(四)红细胞凝集试验 1、50l的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔。 2、被检病毒液5
7、0l分别加入A 、 B行（一行为标准病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50l，12孔为阴性对照。 3、加50l的1%鸡红细胞于每一孔，按病毒的低浓度至高浓度加入。 4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为HA滴度。,6、血凝效价（HA）的确定 将板直立，首先观察红细胞阴性对照，应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即为血凝效价。,(五) 4单位病毒液的配制 以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红细胞凝集现象的最高稀释
8、度是2的9次方(病毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病毒液就为2的7次方.,(六)病毒的红细胞凝集抑制试验 1、加生理盐水50l于96孔板的一排的1-12孔。 2、加标准血清50l于一排第一孔，倍比稀释到第11孔，弃50l。 3、将50l病毒的4个血凝单位抗原加至1到第11孔。 4、然后加50l的1%鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。,实验报告,实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题 某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？ 下次实验 血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171,
