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1、水牛体细胞克隆和干细胞建系关键技术与机理（一）项目名称水牛体细胞克隆和干细胞建系关键技术与机理（二）提名者及提名意见提名者：广西壮族自治区科学技术厅提名意见：水牛作为我国南方的一种宝贵家畜品种资源，因其耐粗饲、饲料转化率高、乳品的营养价值高而极具开发应用前景。但本地水牛的生产性能低下，急需应用先进的繁育技术进行改良。水牛体细胞克隆技术和干细胞技术是水牛遗传改良和快速扩繁的先进技术手段，可实现水牛的定向遗传改良和快速扩繁，培育高生产性能的水牛新品种。然而，由于水牛分布的区域性及种属特性等原因，水牛体细胞克隆技术和干细胞技术的研究进展缓慢，一直没有取得成功。该成果经过系统深入研究，初步探明了水牛卵
2、母细胞成熟机理、体细胞重编程的机理、核质互作关系及克隆效率的影响因素，建立了一套高效的水牛体细胞克隆技术体系，先后获得世界首批体细胞克隆水牛6 头；弄清了水牛干细胞自我更新和多能性维持的分子机理，建立了水牛ES 和EG 细胞的分离培养，以及iPSC 的技术平台，在国际上首次成功获得了水牛ES、EG和iPS 细胞系，并证明它们具有所有干细胞的生物学特征。该成果获得2015年广西自然科学一等奖；先后发表的8篇代表性论文，他引总次数为229次，SCI他引次数为161次，单篇最高SCI 他引次数为67次；体细胞克隆水牛被美国人列为我国20042005 年17项值得关注的科技成就与计划之一。提名该项目为
3、国家自然科学奖二等奖。（三）项目简介本成果属于生物技术领域的动物细胞工程技术，亦属发育生物学和生殖生物学的研究范畴。水牛作为我国南方的一种宝贵家畜品种资源，因其耐粗饲、饲料转化率高、乳品的营养价值高而极具开发应用前景。然而，本地水牛的生产性能低下，急需应用先进的繁育技术进行改良。水牛体细胞克隆技术和干细胞技术是水牛遗传改良和快速扩繁的先进技术手段，可实现水牛的定向遗传改良和快速扩繁，培育高生产性能的水牛新品种，但由于水牛分布的区域性及种属特性等原因，水牛体细胞克隆技术和干细胞技术的研究进展缓慢，一直没有取得成功。为此，本项目组在国家863计划和国家自然科学基金的资助下，对水牛体细胞克隆和干细胞
4、建系的关键技术与机理进行了系统研究，取得了如下创新性的研究成果。1、针对水牛体细胞和卵母细胞活力低、融合困难等问题，创立了卵母细胞纺锤体观测高效去核、铂金针形电极高效融合和DNA合成抑制剂（Aphidicolin)结合血清饥饿培养处理的供体细胞G0/G1期调控等技术方法。组合这些技术方法，建立了一套较为完善的水牛体细胞克隆技术体系，获得了世界首批体细胞克隆水牛6头。3、首次系统证明了供体细胞的个体来源、不同性别印迹基因表达、表观遗传修饰、能量代谢途径和染色质结构与水牛体细胞克隆效率的关系，发现克隆效率高的水牛供体细胞具有旺盛的能量代谢水平和使染色质结构趋于开放的表观遗传修饰特征，雄性克隆水牛的
5、存活与印迹基因IGF-2的异常甲基化和高表达有关，而雌性克隆水牛的存活与印迹基因Xist的异常甲基化和高表达有关。提高组蛋白的乙酰化修饰水平、细胞的糖酵解代谢途径，能提高克隆胚胎的发育潜能。3、证明了水牛诱导多能干细胞（iPSC）的关键转录因子（Klf4 和c-Myc），以及p53信号通路与水牛干细胞自我更新和多能性维持的关系；建立了水牛胚胎生殖样干细胞（EG）、胚胎样干细胞（ES）和iPSC培养的技术体系，在国际上首次成功获得了水牛ES、EG和iPS细胞系，并证明了它们的体外和体内分化潜能。成果获得2015年广西自然科学一等奖；先后发表的8篇代表性论文，他引总次数为229次，SCI他引次数为
6、161次，单篇最高SCI 他引次数为67次；体细胞克隆水牛被美国人列为我国20042005 年17项值得关注的科技成就与计划之一。水牛体细胞克隆技术和干细胞建系技术的建立，可加快良种水牛的繁殖速度，简化水牛的引种程序，实现水牛的定向遗传改良，创制水牛育种新材料。将体细胞克隆技术与转基因技术结合起来，于2010年成功获得了世界首批转基因克隆水牛。（四）客观评价1.体细胞克隆水牛被美国人列为我国0405年17项值得关注的科技成就与计划体细胞克隆水牛在Pillsbury博士提交给美国“中国经济与安全事务委员会”的一份题为“中国科技竞争力的进展：需要重新评估”报告中，被列为我国0405年17项值得关注
7、的科技成就与计划。2、在2008年的创新的中国-亚洲世纪的曙光一书种，世界首例成年体细胞克隆水牛被列为中国的创新与发明技术2008年，伦敦Adonis & Abbery出版公司出版了Greg MacDonald教授主编的创新的中国-亚洲世纪的曙光一书。在该书中世界首例成年体细胞克隆水牛被列为中国的创新与发明技术。3. Reproductive Technologies in Farm Animals一书对克隆水牛进行了评述由英国CAB International出版公司出版的Reproductive Technologies in Farm Animals一书（Ian Gordon著，2017
8、年第二版）对克隆水牛进行了详细评述。书中提到“广西大学对水牛体细胞核移植的影响因素进行了研究，3头移植水牛克隆胚胎的受体水牛受孕，并经过338349天妊娠到期后产下3头克隆水牛犊。这一结果证明，来自颗粒细胞或胎儿成纤维细胞的水牛克隆胚胎能完成妊娠发育并产下新生小牛。尽管2009年印度的研究者们声称获得了世界首例克隆水牛，世界首例克隆水牛在2004年就已由广西大学的石德顺报道成功”。4. 水牛干细胞的相关研究获2009年全国优秀博士学位论文提名论文由项目第一完成人石德顺研究员指导完成的“水牛胚胎生殖样细胞分离培养及相关研究”获2009年全国优秀博士学位论文提名论文。5. 曾获科技奖励情况成果名称
9、获奖时间奖项名称奖励等级所有获奖人（本成果完成人姓名后加“*”）授奖单位水牛体细胞克隆和干细胞建系关键技术与机理的研究2015广西自然科学奖一等奖石德顺*，陆凤花*，刘庆友*，杨素芳*，韦英明*，黄奔*广西壮族自治区人民政府水牛体细胞克隆和干细胞建系关键技术与机理的研究2016第六届中国侨界贡献奖创新成果奖石德顺*中华全国归国华侨联合会（五）代表性论文专著目录序号论文专著名称/刊名/作者年卷页码（xx年xx卷xx页）发表时间（年月 日）通讯作者（含共同）第一作者（含共同）国内作者SCI他引次数他引总次数论文署名单位是否包含国外单位1Biology of Reproduction2007; 77
10、: 285-291.2007.8.1石德顺石德顺，陆凤花韦英明，崔奎青，杨素芳，韦精卫，刘庆友6792否2Theriogenology2005; 64:1309-13192005.4.1石德顺陆凤花韦精卫，杨素芳，韦英明3044否3Stem Cells and Development2012, 2: 2485-24942012.9.1石德顺邓彦飞刘庆友，罗婵，陈思蓓，汪彩珠，刘真真，雷小灿，张慧娜，孙洪亮，陆凤花，蒋建荣1727否4Reproduction in Domestic Animals2010 45： 1221282010.2.1石德顺，黄奔黄奔李童，王晓丽，谢体三，陆阳清1724是
11、5Theriogenology2013, 80:878-8852013.11.1石德顺罗婵陆凤花王晓丽，王志强，李湘萍，公方强，蒋建荣，刘庆友1618否6Cell Biology International2007, 31: 1079-10882007.10.1石德顺黄奔谢体三，李童，王晓丽，莫毅，王志强，李梦梅614否7Theriogenology2011, 76:9679742011.9.15石德顺陆凤花，蒋建荣李楠，张顺，孙洪亮，罗婵，韦英明55否8Cellular Reprogramming2015, 17: 404-4142015.10.1石德顺孙洪亮，陆凤花朱鹏，刘晓华，田明明，罗
12、婵，阮秋燕，阮子芸，刘庆友，蒋建荣，韦英明35否合 计161229（六）主要完成人情况姓名工作、完成单位行政职务/技术职称对本项目技术创造性贡献石德顺广西大学研究员负责项目的组织实施，研究方案制定，主要代表性论文撰写和研究过程中的具体问题解决。陆凤花广西大学研究员具体负责水牛体细胞克隆的技术操作工作，参与项目研究方案的整体设计、技术路线制定和论文的撰写工作。刘庆友广西大学研究员主要负责克隆水牛鉴定的STR位点筛选与方法建立；水牛诱导多能性干细胞的转录因子克隆与诱导方法建立。杨素芳广西大学教授主要负责体细胞核移植和干细胞方面的研究工作。重点建立水牛卵母细胞激活的方法、水牛卵母细胞的Spindle
13、-View高效去核方法，参与建立和完善了水牛体细胞克隆技术平台。韦英明广西大学研究员负责胚胎移植和实验水牛饲养管理，研究解决胚胎移植的具体问题。(七)完成人合作关系说明完成人同属一个课题组，课题组长是成果第一完成人石德顺研究员。成果第二完成人陆凤花研究员是石德顺研究员的硕士和博士研究生，2004年毕业后留校工作，一直参与成果研究的相关工作。成果第三完成人刘庆友研究员是石德顺研究员的硕士研究生，2004年获得硕士学位后到北京基因组研究所攻读博士学位，2007年获得博士学位后回课题组工作，一直参与课题组的相关研究工作。成果第四完成人杨素芳教授是石德顺研究员的硕士和博士研究生，2002年获得博士学位后留校工作，一直参与课题组的相关研究工作。成果第五完成人韦英明研究员是石德顺研究团队的主要成员，主要动物基地的管理和胚胎移植工作，合作共事20多年。- 10 -
