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1、上节课的重点内容,1.掌握真核基因表达调控的特点； 2.掌握顺式作用元件、反式作用因子的概念及组成和转录因子的分类.,复习与巩固,是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。,一.基因工程(genetic engineering),第一节 基因工程,基因工程相当于目的基因的无性繁殖过程，也称其为基因克隆(gene clone)或分子克隆（molecular clone）。,第14章 基因工程及其在医学中的应用,重组DNA技术中常用的工具酶,二、 基因工程操作中常用的工具,（一）工具酶,限制性内切酶,(restriction endonuclease),定义
2、:是一类能识别和切割双链DNA分子中 特定碱基序列的核酸水解酶,型限制酶识别序列特点回文结构,一般识别双链DNA的48个核苷酸顺序，其中以6个核苷酸顺序最为常见。,EcoR,+,Hpa,+,平端切口,粘端切口 （5和3突出端）,切口：黏性切口和平端切口,（二） 载体,1.定 义：是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增 和表达的工具。,2.分 类： (1)克隆载体(cloning vector):使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 (2)表达载体(expression vector):使插入的外源DNA序列转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,质粒 (plas
3、mid),特点,存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的 拷贝数并表达其遗传信息,常用载体：细菌质粒 噬菌体 黏粒 病毒,特点： 多克隆位点 筛选标记,三 、基因工程的操作过程,基本过程,目的基因的获取,重组DNA分子导入受体细菌,目的基因与载体的连接,克隆(或表达)载体的选择和构建,重组体的筛选与鉴定,克隆基因的表达 和表达产物纯化,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获得,1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(
4、genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,* 从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,目 录,基因组DNA文库,cDNA文库,粘性末端连接,（二）目的基因与载体的连接,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平
5、端,转化、转染和转导的区别,（三）重组体导入受体细胞,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,（四） 基因工程菌的筛选,直接选择法： 抗药性标记选择 蓝白斑筛选法 菌落或噬菌体的原位杂交,非直接选择法：免疫学方法,(插入失活法) 抗药性标记选择,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,（五） 外源基因的表达,克隆载体和表达载体的比较,分子杂交以DNA的变性和复性为理论基础。 DNA变性：DNA在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程。 DNA的复性：变性DNA的单链重新合成双链的过程。 分子杂交：不同来源的单链核酸通过碱基互
6、补形成杂合双链的过程。,分子杂交,第二节 常见分子生物学技术 一、分子杂交（molecular hybridization）,复性,RNA,DNA,（一） 核酸探针（probe）,1、定义： 是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测核 酸序列互补的带有标记的核苷酸片段，长度一般为 十几到几千个碱基不等。,2、探针标记方法： （1）放射性同位素标记 （2）光敏生物素标记 （3）地高辛标志物 （4）分子信标,（二 ）分子杂交的方法,斑点杂交(dot blot hybridization) DNA点阵（DNA array） 基因芯片 （gene chips） 原位杂交(in situ hybridiz
7、ation) 转移印迹技术,变性DNA或RNA,探针杂交液,NC 硅片,（三）印迹技术的类别及应用,1、DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,2、RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,3、蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,二、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR),PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,95C,55C,72C,PCR的主要用途,（一）目的基因的克
8、隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）测定基因的表达水平,三、DNA的序列分析,放射自显影,凝胶电泳,碱性专一性裂解反应,A/G,G,C/T,C,5GTCGTAA,5GTCGTA,5GTCGT,5GTCG,5GTC,5GT,5G,-,-,+,（一）化学裂解法(Maxam-Gillbert法),（二）DNA链末端合成终止法,四、转基因动物、克隆动物 和基因剔除技术,（一）转基因动物,定义 是利用基因工程和胚胎工程技术，改变动物遗传 性状的新方法，是将外源基因导入动物受精卵， 再将受精卵植入到代孕动物的输卵管或子宫中培 育的动物。,目 录,（二）克隆
9、动物,核转移技术 将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,多利诞生过程,（三） 基因剔除技术,也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。又称基因敲除（gene knockout）。 基因敲入（gene knockin）,定义：是指利用分子生物学和分子遗传学的技术方 法通过直接检测基因结构是否改变、基因表 达有否异常，对疾病作出诊断。,基因诊断的概念和特点,特点： 针对性强；灵敏度高；适用范围广；早期诊断,第三节 基因工程在医学中的应用 （一）基因诊断（gene diagnosis）,甲型血友病基因组的限制性酶切分析,正常基因,基因治疗的概念,早期将通过基因转移技术用正常基因原位置换有 缺陷的基因治疗单基因遗传病叫做基因治疗。 目前广义上来讲,将某种遗传物质转移到患者细 胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病 目的方法，均称为基因治疗。,（二）基因治疗（gene therapy）,1.掌握基因工程和限制性内切酶的概念； 2.掌握限制性内切酶的识别序列的特点。 3.掌握转化、转染和转导的区别； 4.掌握重组DNA技术的大致操作过程； 5.掌握分子杂交、基因诊断和基因治疗的概念； 6. 掌握PCR的原理和步骤。,本节课的重点,
