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1、第二十章 分子生物学常用技术原理 及其应用,第8版 生物化学与分子生物学,核酸分子杂交碱基互补配对,分子杂交与印迹技术,DNA印记（Southern Blotting） RNA印记（Northern Blotting） 蛋白免疫印记（Western Blotting）,印迹技术的类别及应用,DNA印迹技术 (Southern blotting) 基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析,RNA印迹技术 (Northern blotting) mRNA的分析,蛋白免疫印迹分析 (Western blotting) 蛋白质定性定量及相互作用研究,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移
2、动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE ） ：,点样,电泳方向,放射自显影后的X光底片,核酸杂交检测方法：Southern Blotting,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示,Northern blotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品 主要检测目的mRNA转录水平、表达情况（组织特异、
3、时空特异）。 从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,免疫印迹（Western Blotting）法,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带 原理： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,SDS:是蛋白质的变性剂，使蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷,Dalton,凝胶中的蛋白质染色：,直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 转到膜上进行染色,直接染色电泳结果,Western Blotting, Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（
4、硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上,Western装置,Blotting,原理与ELISA相同,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,待测蛋白,底片曝光,Blotting过程,先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。 洗去未结合的一抗。 用二抗与一抗结合（二抗上带有辣根过氧化物酶） 清洗掉未结合的二抗。 用辣根过氧化物酶的底物浸泡膜。 暗室里曝光，冲洗胶片,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,斑点印渍 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hy
5、bridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip),其他：,基因芯片,基因芯片,基因芯片,DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。,基因芯片,基因芯片(gene chip),是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),PCR,原理与应用,体外基因扩增技术-PCR,基
6、因扩增（gene amplification) 指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：,1. 环境诱发扩增 2. 基因的程序性扩增 3. 基因组进化扩增 4. 基因工程扩增 5. PCR扩增,基因扩增（gene amplification),1. 环境诱发扩增 在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。 如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。 2. 基因的程序性扩增 在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。 如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。,基因扩增（gene amplification),3. 基因组进化扩增 生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，
7、结果相关的基因聚集成簇 4. 基因工程扩增 载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制 5. PCR扩增 应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因,PCR（Polymerase Chain Reaction）的发明,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想 当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现 1977年，Sanger测序方法建立 单引物、体外的DNA聚合酶（非耐热酶） 1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实,Mullis由此获得1993年
8、诺贝尔化学奖,PCR技术的原理,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,升温，DNA模版打开为单链,降温，DNA模版与引物配对,升温，DNA合成,3 step and 30 cycles for PCR,Step 1. 变性,Step 2. 退火,Step 3. 延伸,30 cycles,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA,Step 1. Denaturation（变性）,The reaction is first heated to denature (separate) the sides of the double- stranded DNA,Temperat
9、ure: 95 degrees Celsius,Step 2. Anneal（退火）,Temperature: 55 degrees Celsius,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,引物（primer）:,引物优先： 引物的浓度高， 引物的链短。,Step 3. Extend（延伸）,the polymerase to extend the primers into new complementary strands.,Temperature: 75 degrees Celsius,Repeat the Cycles,Repeated heati
10、ng and cooling cycles multiply the target DNA exponentially, since each new double strand separates to become two templates for further synthesis.,1个循环后的结果,第2个循环后的结果,模版,第1次的产物,第2次的产物,A,A,B,B,C,D,第3个循环后的结果,第3次的产物,第4个循环后的结果,第4次的产物,1A，1B，1C，1D，2E,A,B,C,D,2E,1A，1B，1C，1D，4（22）E,A,B,C,D,4E,第N个循环后的结果,第N次的产
11、物,1A，1B，1C，1D，2n-1 E,2n-1 E,A,B,C,D,PCR反应结果电泳图,Taq DNA 聚合酶,最初使用：大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37）不耐热 Taq DNA聚合酶：1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的，PCR技术才进入实用阶段 1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能,PCR 仪,1988年 Cetus公司发明自动热循环仪,复性,延伸,变性,95oC 5min,50oC 1min,72oC 2min,94oC 1min,温度循环,30个循环,PCR反应体系包括：,模板
12、：双链DNA（如：基因组） 引物一对：短的DNA片段 上游引物：其序列与目的片段5端互补 下游引物：其序列与目的片段3端互补 DNA聚合酶：如Taq酶 dNTP Mg 2+ 缓冲液 增稠剂，如BSA等,PCR的特点,特异性强 PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。 这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性 敏感性高 需要的模板量极低 理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条 快速 整个PCR过程几个小时即可完成,PCR的特点,简便 不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板 可以扩增mRNA RT-
13、PCR： 先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增,反转录PCR（RT-PCR),扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增,Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq酶,PCR,Reverse transcription (RT),下游引物,上游引物,Taq酶,PCR技术的应用,（1）
14、扩增某一段DNA 大量获得目的片段 从基因组中扩增 从载体上扩增 组织样本原位扩增 组织分布分析 微量残留DNA扩增 犯罪现场微量DNA样本的法医学鉴定 分析模板序列 考古、微量生物样本物种分析,PCR技术的应用,（2）基因的突变 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,技术关键：利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,（3）实时PCR技术,实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。,有多种方法可进行实时PCR：,1. TaqMan探针法实时PCR技术原理,2.分子
15、信标探针法,游离探针：发夹结构 探针结合靶序列后：发夹结构打开，发出荧光信号,http:/www.bio- resonance energy transfer）探针法,http:/www.bio- Green荧光掺入法,基 因 文 库 Gene Library,第 四 节,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,cDNA文库,第五节,生物大分子相互作用研究技术,The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白
