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1、第5章 CellQuest Pro软件5.1 概述CellQuest Pro是从流式细胞仪上进行数据获取和分析的通用软件。使用者可由CELLQuest Pro软件来从事仪器之调整与设定，可用以进行细胞检品的检验测量，CELLQuest Pro软件同时是细胞仪的数据处理系统内的必要软件。在数据分析方面，CELLQuest Pro软件提供使用者双色或多色分析功能，可以定量各类细胞族群的百分比，细胞受染的荧光强度，也可以制作一维直方图、二维散点图、二维密度图、二维等高线图、及三维图谱，并且可作文字处理的中间插图，无需再剪贴拼凑，适用于论文发表，及会议报告使用。CELLQuest Pro软件功能强大且
2、灵活，并与Macintosh 的多任务环境完全兼容。5.1.1 收取 (Acquisition)即收取并储存流式细胞仪上数据的过程。在收取前，需用您的样本来最佳化仪器的条件。5.1.2 分析 (Analysis)将收取的数据进行进一步分析。在分析时，将读取数据文件，然后可画Region (区)、 设置Marker (界限)、和进行统计。在CellQuest中，可画单参数直方图、双参数散点图、密度图和等高图。5.1.3 从收取到分析 (AcquisitionAnalysis)在CellQuest中，从收取到分析的功能允许在数据收取结束后可从收取图转换到分析图。刚刚收取的数据及在收取时限定的格式出
3、现在图中，如Region, Marker 等。5.2 工具栏工具栏在CellQuest Pro软件启动后就会出现，见图一。工具栏可用来画图、选择区域、设置标尺和输入文本等。选择点击，可选择一个或多个目标，进行改大小或移动。C： 等高图(Contour Plot)，点击，可画等高图，可自定义图的大小。3D：3 维图，点击，可画3维图，可自定义图的大小。H： 直方图，点击，可画直方图，可自定义图的大小。D： 密度图，点击，可画密度图，可自定义图的大小。d： 点图：点击，可画点图，可自定义图的大小。H：直方图 marker：点击，可在直方图上定位 marker 的左边界和右边界。Q：象限 marke
4、r：点击，可在点图、密度图和等高图上定位 marker 。缩小：点击，然后点击图，将放大图缩小到原大小。图1 工具栏按钮放大：点击，然后点击图，将缩小图放大到原大小。R：矩形区域,点击，然后在点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需 大小。P：多边形区域，点击，然后在点图、密度图和等高图中点击形成起始点，然后拖动鼠标 画出多边形顶点并在起始点处点击完成多边形区域 。H：直方图区域，点击，可在直方图上定位区域的左边界和右边界。E：椭圆形区域，点击，然后在点图、密度图和等高图中点击，然后拖动对角线至所需大小。箭头，点击，然后在实验文件中点击，拖出直线。文本：点击，然后点击定位插入点并编辑文
5、字。公式栏：点击，出现的对话框中可以输入客户定义的数学公式，在实验文档上出现的结果也可以添加注释。计算器：如果自动复计算关闭，点击进行数据复计算。5.3 CellQuest Pro文件类型5.3.1 FCS数据文件是流式细胞仪的标准格式数据文件。FCS数据文件中自动保存了每个微粒所有的参数信息和对应的仪器条件。当Aqusition Control 窗口的set up前未打 时，进行获取后自动保存的文件格式。该文件含有从流式细胞仪获取的平均2000-10000个颗粒数的数据。一个含有4参数10000细胞数的数据文件若256道分辨率则文件大小为45kb，若1024道分辨率则文件大小为85kb。5.
6、3.2实验文件实验中设置的图、区域、门、统计结果、marker、文字、颜色 等都将保存。数据文件不在实验文件中保存。CellQuest Pro实验文件的菜单有File菜单下New、open、close、save及save as等(同Microsoft Word)。注意：实验文件和它的数据文件之间存在一定限制。若数据文件未改变地址或未被删除，实验文件可找到其数据文件。若二者联系丧失，需将丢失的数据文件与其实验文件放在同一目录，实验文件才能找到其数据文件。若实验文件的目录改变，二者的联系不会改变，实验文件仍可找到其数据文件。l 实验文件可以后打开以恢复获取和分析。l 实验文件可以通用模板储存以用于
7、常规获取和分析。除数据文件外所有条件（包括region、gate、statistics）都可以通用模板储存。l 实验文件可转化为文具薄。l 在实验文件中，有3种图：获取、分析和获取到分析。一个实验文件可含上述3种图的组合，但获取图不能用来分析，分析图不能用来获取。5.3.3 仪器条件文件实验条件文件中包括仪器的电压，阈值，补偿等仪器条件。这些条件也已经自动保存在FCS数据文件中的文档部分。也可以单独保存成一个仪器条件文件。5.3.4 统计文件所有直方图、区域、门和象限统计结果都可以输出成表符限制性文档。这些输出文件可用于将数据转移到其他应用软件中，如电子表格或数据库。5.4 CellQuest
8、 Pro的仪器控制在CellQuest Pro软件中，仪器的控制选单位于Cytometer菜单中。用CellQuest Pro进行3色分析中，应用阴性对照和调补偿用对照进行仪器条件设置。阴性对照可用不加抗体组或同型对照组。它将用于调节FSC、SSC探测器、FSC阈值、设淋巴细胞区region、确认FL1/FL2/FL3的设置及象限设置。调补偿用对照包括单阳性荧光试剂，如包括下列试剂：CD8 FITC组、CD19 PE组、CD3 PerCP组。调节探测器和放大器可使所需信号出现在数据图的适当位置。细胞通过激光束时产生光信号，然后转换成电信号，并在散点图上相对应于一个道值。依据所选的分辨率的不同，
9、道值有0-255、0-1023不同范围。5.4.1 探测器（Detector）在流式细胞仪中有二种探测器：光电二极管和光电倍增管(PMTs)。 光电二极管对光 的敏感度低于光电倍增管。探测器的调节菜单位于Cytometer菜单下Detector/Amps，调节窗口如下图所示。光电二极管用于探测FSC，因为FSC是强信号，可通过电压而选择对FSC 信号 的不同放大。E00：将信号放大1(100)倍。E01：将信号放大10(101)倍。E02：将信号放大100(102)倍。E03：将信号放大1000(103)倍。 E-1：将信号放大0.1(10-1)倍。 光电倍增管(PMTs)用于探测SSC、FL
10、1、FL2、FL3, 因为它们是弱信号。 PMTs的电压调节 从150-999。当电压上升时，信号增加，数据出现在道值较高处。可通过点击 来选 择或直接拖动滑标上下移动(见上图)。放大器（Amp Gain）：可对信号进行微调。对FSC、SSC、FL1、FL2、FL3 可设置放大模式和放大增益。 若放大模式选择Lin (线性)，放大器的增益可在1-9.99之间调节。可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。若放大模式选择Log (对数)，放大器的增益则不可调节。对数常用于分开阴性信号和弱阳性信号。5.4.2阈值 （Threshold）：可用来设置低于该道值的数据信号不被处理，只有高于阈值道数的信号
11、才传送到计算机进行处理。每次只能有一个参数设置阈值 (FSC、SSC、FL1、FL2、FL3)。 在免疫表型中，在FSC上设阈值。在DNA分析中，在FL2上设阈值。可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。5.4.3荧光补偿（Compensation）：当样本用2色或3色荧光染色时需调节补偿以消除光谱重叠。因为荧光素发射一定波段的荧光，因此在探测某种特定荧光素的探测器上有来源于另一种荧光素的荧光信号。FITC主要出现在FL1探测器上，但也有部分重叠到FL2探测器上。PE主要出现在FL2探测器上，但也有部分重叠到FL1和 FL3探测器上。补偿调节如下： FL1-FL2： 从FL1探测器上减去重叠的
12、FL2 FL2-FL1： 从FL2探测器上减去重叠的FL1 FL2-FL3： 从FL2探测器上减去重叠的FL3 FL3-FL2： 从FL3探测器上减去重叠的FL2补偿调节量依赖于探测器的电压。当补偿过后的群体与阴性群体一致时，补偿调节正确。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。5.4.4仪器状态（Status）： 在菜单位于Cytometer菜单中。用来在收取的任何时候查看流式细胞仪的运行状态，以利解决仪器运行中出现的问题。测试脉冲：在FACSCalibur中可从Status菜单中选择FSC：仅FSC探测器上产生的信号、或ALL：所有探测器上产生的信号、或OFF。（注意：只在工程人员
13、指示下可启动此测试信号。）状态：显示仪器运行模式Not Ready：激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。Ready：样本管插在SIP上且支撑臂位于中位(即管下)，样本管加压，仪器在RUN状态。Standby：仪器在Standby 状态或仪器在Run 状态而无样本管在SIP上或支撑臂位于侧位(即不在管下)或样本管未完全加压。Standby时仪器的激光器电源降低。激光器电源：以mW表示，在RUN时，为15mW；在Standby 时，为4-6 mW 。激光器电流：显示激光器电流值，当高于某值时，在显示屏上会出现提示信息。样本电压：显示样本压力和鞘液压力之间的差异。当插上样本管于上样区时，样本压力和鞘
14、液压力之间的差异增加，该样本电压降低。鞘液：显示鞘液桶是空或OK。废液：显示废液桶是满或OK。5.5 CellQuest Pro的视图 在实验文件中，可画图和作统计图。它们在显示上有三种形式：5.5.1启动（Activated）：外方框呈灰色。点击除方框以外的任何地方即可启动。每次只能启动一个图。 任何命令只针对此启动的图。5.5.2被选择（Selected）： 在每个角出现黑色方框。点击图方框即可选择该图。一次可选择多个图。任何命令可 影响被选择的图。可通过下列2种方式选择多个图：揿Shift键同时点击多个图方框或在实验文件中点击任何对角线拖方框包绕欲选的图。若需全选，可从Edit 菜单中选
15、择select all。 只要被选图才可以更改大小、删除和移动。5.5.3去选择（Deselected）：图方框的每个角无黑色方框。点击图外的任何地方即可去选择。去选择的图不受任何命令影响。 5.6 FACSCalibur仪器的调试在此练习中，您将： 建立CellQuest 实验文件。 调节FSC、SSC探测器和FSC阈值。 画淋巴细胞区、设门。 调节FL1、FL2、FL3探测器。 调节荧光补偿。FACSComp用标准微球调节仪器设置之后需用样本优化仪器设置。上述优化步骤不仅适用于溶解的全血细胞，而且适用于任何感兴趣的细胞。必须记住按上述步骤次序进行。为按上述步骤进行优化，需准备下列样本： 小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。 CD3-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。 小鼠IgG1-FITC/CD8-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。 小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1
