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1、肇 庆 学 院生命科学学院 生物化学 课实验报告 实验老师 李芸瑛 12级 生物科学3班5组 姓名：张鹏 学号：36实验日期：2013年11月27日实验题目 植物中脯氨酸含量的测定 实验目的：了解植物体内脯氨酸含量对植物抗寒性的影响，掌握标准曲线法测定蛋白质质量浓度的基本操作和722型分光光度计的试用和操作方法。实验原理：采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 样
2、品在520nm波长下比色，即可从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。实验材料：木瓜叶叶片实验器材：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 胶头滴管；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。实验试剂： 1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热 （70）溶解，贮于冰箱中。 2. 3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。 3.冰醋酸。 4.甲苯。实验步骤：1.标准曲线的制作（1）在分析天平上精确称取2
3、5mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。 （2）系列脯氨酸浓度的配制 取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。 （4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。 （5）用胶头滴管轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，
4、以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。 （6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）根据吸光度测定，所得数据如下：编号123456脯氨酸浓度（g/2ml）24681012吸光度0.0670.0830.1240.1650.2390.2762. 样品的测定 （1）脯氨酸的提取 准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 （2
5、）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。 （3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。 （4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值为0.489。实验结果：根据系列脯氨酸浓度液吸光度的测定，得标准曲线如下：根据标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），根据公式y=0.222x+0.0036，得脯氨酸含量为21.86g/2ml。结果计算： 计算公式如下：单位
6、鲜质量样品的脯氨酸含量（%）其中，X为从标准曲线查处的2mL测定液中脯氨酸的含量（ug/2mL);VT为提取液体积（mL);VS为测定是取用的样品体积（mL)；W为样品质量（g)。X=21.86g/2ml VT=2ml VS=2ml W=0.5g把以上数据代入公式计算，得木瓜叶中所含脯氨酸为0.4372%。注意事项：1. 实验过程中系列脯氨酸浓度的配制过程一定要精确无误才能尽量减少实验的误差，使标准曲线较为准确。2. 我们确保把木瓜叶片剪得足够细碎，并研磨充分使脯氨酸充分释放出来，使得最后提取的脯氨酸含量尽量接近木瓜叶所含脯氨酸的量。3. 酸性茚三酮溶液要现场配置好，否则其中的醋酸挥发后就会导
7、致结果出现偏差配置。4. 配制酸性茚三酮溶液和后续使用酸性茚三酮溶液进行染色的过程中注意不要弄到皮肤上。5. 与酸性茚三酮溶液的反应一定要反应足够长的时间才能使脯氨酸充分染色，否则会使最后测得的样品吸光度偏低。6. 沸水浴加热的过程中注意反应时间要充分。实验分析：植物体内的脯氨酸含量直接反映了植物的耐寒能力，因此植物耐寒性越高，体内所含脯氨酸含量也越高。遗憾的是，由于我们学校地处南方，气候温暖，我们没能在附近找到能在北方广泛存在的常绿植物如小麦高粱等，所以只能采用一些南方的常绿植物来进行实验。使用茚三酮溶液本该要小心，但是染色过程中手还是被茚三酮溶液染成了紫色。另外在过滤操作的过程中比较难过滤充分，总是有部分滤液残留于滤渣中可能导致结果偏小。并且过滤所得的提取液非常少，大概勉强达到2ml，给吸取工作造成很大的麻烦。后来的吸光度测定工作，都是多次重复进行测定，取数次测定的平均值，以减少实验的误差使实验结果更精确。第二和第三梯度的浓度偏低有可能是因为配制时加入的甲苯溶液太多而造成的。此外，我们没有料到木瓜叶片内含的脯氨酸含量高，而导致测的数值超出我们所制作的标准曲线图，浓度配得太稀。实验的其他步骤都没有出现其他差错，因此实验结果应该比较可靠。
