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1、第 2 章,蛋 白 质 (Protein),蛋白质的分类,蛋白质的组成单位-氨基酸,肽,蛋白质的结构,蛋白质结构与功能的关系,蛋白质的性质与分离、分析技术,内容提要,是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子。,纤维状,球状,蛋白质(Protein),蛋白质的生物学作用,蛋白质是生物体的重要组成成分 蛋白质具有重要的生物学功能 1）作为生物催化剂（酶） 2）物质的转运和储存 3）运动与支持作用 4）免疫保护作用 5）代谢调节作用 6）参与细胞间信息传递 氧化供能,蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细
2、胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,2.1.1依据蛋白质的形状分类 1）球状蛋白质：（globular protein）外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。 2）纤维状蛋白质(fibrous protein)分子构象类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。 3）膜蛋白质,2.1 蛋白质的分类,2.1.2依据蛋白质的组成分类,1.简单蛋白(simple protein) ：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分
3、。 （1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。 （3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,（1）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 （2）糖蛋白与蛋白聚糖：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。糖与蛋白质的结合方式：O连接和N连接 （3
4、）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 （4）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。 （5）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结 合而成,2.1.3按功能分类,酶 调节蛋白 贮存蛋白 转运蛋白质 运动蛋白 防御蛋白和毒蛋白 受体蛋白 支架蛋白 结构蛋白 异常功能,2.2 蛋白质的组成单位-氨基酸,氨基酸 （amino acid) 是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸组成。,2.2.
5、1氨基酸的结构通式,氨基酸的结构式书写,20种常见氨基酸的名称和结构式,甘氨酸(a-氨基乙酸) Glycine,丙氨酸(a-氨基丙酸) Alanine,亮氨酸(-甲基-a-氨基戊酸)* Leucine,异亮氨酸(-甲基-a-氨基戊酸)* Isoleucine,缬氨酸(b-甲基-a-氨基丁酸)* Valine,脯氨酸(a-四氢吡咯甲酸) Proline,苯丙氨酸(b-苯基-a-氨基丙酸)* Phenylalanine,蛋(甲硫)氨酸 (a-氨基-甲硫基戊酸) * Methionine,色氨酸 a-氨基-(3-吲哚基)丙酸* Tryptophan,丝氨酸(a-氨基-羟基丙酸) Serine,谷氨酰
6、胺(a-氨基戊酰胺酸) Glutamine,天冬酰胺(a-氨基丁酰胺酸) Asparagine,苏氨酸(a-氨基-b-羟基丁酸)* Threonine,半胱氨酸(a-氨基-b-巯基丙酸) Cysteine,酪氨酸(a-氨基-对羟苯基丙酸) Tyrosine,天冬氨酸(a-氨基丁二酸) Aspartic acid,谷氨酸(a-氨基戊二酸) Glutamic acid,赖氨酸(a,w-二氨基己酸)* Lysine,精氨酸(a-氨基-d-胍基戊酸) Arginine,组氨酸a-氨基-b-(4-咪唑基)丙酸 Histidine,20种标准氨基酸,蛋白质的元素组成：,C（5055%）、H（68%）、O（
7、2023%）、N（1518%）、 S（04%）、,Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等,蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。 由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量蛋白氮6 .25,6 .25 16的倒数，每测定g 氮相当于6 .25g的蛋白质。也就是1 g 氮所代表的蛋白质量（克数）,蛋白质含量的测定（自学）,凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单， 方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮) 都归入蛋白质中,不精确。
8、 除了上法外，还有 双缩脲法 ，Folin酚，考马斯亮兰G250比色法等,总结,从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为： (1)与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸 (2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以： A.氨基酸都具有旋光性，左旋（-）或右旋（+） B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,2.2.2氨基酸的分类,1.根据R的化学结构 （1）脂肪族氨基酸： 1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys； 2）
9、极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr （2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr （3）杂环氨基酸：Trp、His （4）杂环亚氨基酸：Pro,2.根据R的极性 （1）极性氨基酸： 1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys； 2）带正电：His、Lys、Arg； 3）带负电：Asp、Glu （2）非极性氨基酸： Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,总结,属于芳香族氨基酸的是： 色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe 属于亚氨基酸的是： 脯氨酸Pro 含硫氨基酸包括： 半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met 分子量最小的氨
10、基酸是:甘氨酸Gly 能形成二硫键的氨基酸是:半胱氨酸Cys 含二羧基一氨基的氨基酸有: 谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,几种特殊氨基酸,这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的,几种特殊氨基酸,2.2.3氨基酸的重要理化性质,一般物理性质: 氨基酸一般有味（无味、甜、苦、鲜等） 一般均溶于水，溶于酸、碱中；不溶于有机溶剂。 高熔点（200以上）,氨基酸的旋光性及立体异构 除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性左旋（-）或右旋（+），比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,氨基酸的光吸收,构成
11、蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257nm，色氨酸的max280nm。,氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，为两性电解质。,(1)两性解离和等电点,调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的+NH3基和COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。,（当氨基酸相互连接成蛋白质时，
12、只有其侧链基团和末端的-氨基，-羧基是可以离子化的。）,氨基酸等电点的确定：,1）酸碱滴定（滴定曲线）,2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算： 等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。,推导过程,pI =1/2(pKl+ pK2),推导过程,对多氨基和多羧基氨基酸的解离,解离原则：,注意,推导过程,结论,中性氨基酸：pK1，为羧基的解离常数，pK2，为氨基的 解离常数。 pI=(pK1，+pK2，)/2 酸性氨基酸：pK1，为羧基的解离常数，pK2，为侧链羧基的解离常数。 pI=(pK1，+pK2，)/2 碱性氨基酸： pK2，为氨基的解离常数，pK3，为侧链氨基的解离常数。 pI=
13、(pK2，+pK3，)/2,应用,pH pI aa “ - ” aa向正极移动 pH pI aa “ + ” aa向负极移动 pH = pI aa “ 0 ” aa不移动 溶液的pH偏离pI越远，氨基酸带净电荷越多，在电场中越容易分离。 利用不同的氨基酸在同一pH下所带电荷不同而分离，如用阴离子交换树脂柱层析分离氨基酸。 等电点时,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。,自 测,丙氨酸Ala的 pI6.02，在pH7时，在电场中向（ ? ）极移动。,(2)氨基酸的化学性质,氨基酸在溶液状态时,存在的平衡,1）与茚三酮的反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还
14、原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,脯氨酸与茚三酮反应的产物：,N+,黄色化合物,反应要点与应用,A.该反应由-NH2与-COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.用于氨基酸的定性、定量分析 该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 测定范围：0.550g/ml D.脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）,2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释
15、放氢离子。,应用,氨基酸定量分析-氨基酸的甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） 简单快速，一般用于测定蛋白质的水解或合成的速度,3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,弱碱性,DNP-氨基酸（黄色）,A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子，在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成黄色的2,4二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸，稳定）,应 用,鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 此反应首先由Sanger应用测定蛋白质中氨基酸的排序，
16、确定了胰岛素的一级结构 5二甲氨基萘磺酰氯（DNSCl，又称丹磺酰氯）可以代替DNFB试剂测定蛋白质的N端氨基酸,肽链氨基末端残基的检测（ Sanger法）,黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的 迁移特性进行鉴定,二甲氨基萘磺酰氯的简称丹磺酰氯 可以取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,与5-二甲氨基萘磺酰氯的反应,（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,反应特点及应用,为- NH2的反应 由Edman于1950年首先提出 用于N末端分析，又称Edman降解法, 此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,5）与亚硝酸的反应,NH
