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1、微生物上游技术综合实验报告书（20132014学年）实 验 题 目：柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选学 院 名 称：生物与化学工程学院柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选前言：柠檬酸(也称构椽酸)是重要的有机酸,是柠檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。柠檬酸发酵生产目前所采用的菌种
2、主要是黑曲霉菌种和酵母菌菌种，而淀粉质原料发酵主要以黑曲霉菌种为主。对于柠檬酸发酵行业来说，菌种产酸水平的高低是决定柠檬酸发酵生产的关键因素之一，因此，柠檬酸菌种黑曲霉的选育研究一直成为科研人员关注的焦点，国内外有很多关于柠檬酸发酵菌种黑曲霉选育的研究报道。我国柠檬酸生产菌种的发酵水平经过几十年的努力，工业产酸水平平均达到13%以上，尽管我国柠檬酸发酵技术在世界上暂时处于领先地位，但菌种选育方面的竞争依然形势严峻。因此，应当加快产柠檬酸产生菌的研究，继续筛选高产柠檬酸的优良菌株，扩大产柠檬酸菌种的来源。本实验主要进行了土壤中柠檬酸高产菌株黑曲霉的筛选、形态、产酶条件及酶学性质的研究。黑曲霉（A
3、spergillus niger）的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生孢子。黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般pH值为37；产酸最适pH值为1.82.5。生长最适（optimum）温度为3336，产酸最适温度在2836，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在35Be左右的麦芽汁培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，
4、能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。1、材料与方法1.1材料1.1.1土样肥沃花坛土、草坪土、菜园土、果园土各一份1.1.2培养基平板培养基（察式培养基）蔗糖 30g NaNO3 2g MgSO47H2O 0.5gKH2PO4 1g KCl 0.5g FeSO47H2O 0.01g溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然分离培养基（PDA培养基）马铃薯 300g 葡萄糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 自然PH发酵培养基（玉米粉发酵与糖蜜发酵）玉米粉 300g 淀粉酶 10g
5、 蒸馏水 1000ml蔗糖 150g 甲醇 30ml 1.1.3 仪器1.2 试验方法1.2.1 土样采集选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深约 5cm 的土壤样品 ，装入灭菌牛皮纸袋中，4冰箱中保存。将土样混合均匀，4冰箱保存。1.2.3 菌株分离( 平板分离法)土样稀释：取混合土样 10g 装入 90ml 无菌水的三角烧瓶中。按常规稀释法稀释土样。保留 10 2，10 3，10 4 的土壤稀释液待用。涂布与培养: 取 10-1，10-2，10-3 稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布 3 个培养皿。33恒温箱倒置培养 34d。观察与保存: 培养 3
6、4d 后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。1.2.4 筛选采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。33恒名称 型号 备注生化恒温培养箱 SPX250B Z型 上海博讯实业有限公司医疗设备厂高压灭菌锅 YXQ.SG41.280 上海医用核子仪器厂振荡摇床 ZHWY 2102C 上海跃进医疗器械台式离心机 TGL 16 上海医疗器械三场温培养箱中培养 34d.。通过观察变色圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低。然后用直尺测出菌落与变色圈直径，根据平板上变色圈直径和菌落直径的比值( C/H) ，选出比值较大的菌株。1.2.5 复筛将初筛得到的 3 种菌株( R1，R2，R3) 分别接于
7、发酵培养基中，30摇床培养 46d。取发酵液离心后即得粗酶液，用细针头注射器取 1ml 发酵液用 NaoH 溶液滴定，然后测定产酸量与计算产酸率。2、实验设计方案以生化学院周围土壤为原材料进行柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选与分离。分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并初步对其进行形态鉴定。利用变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标。以了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法及初步掌握菌种筛选方法设计为目的筛选出一株产酸能力较强的黑曲霉菌株。3、结果与分析3.1黑曲霉的初步筛选与形态鉴定在初筛培养基上用肉眼观察菌落特征：平扳培养基上初为自色、平坦，后中心微隆变黄色，再变棕黑色，菌落正反
8、颜色一致，生长速度很快，培养4d后菌落直径达4cm以上，菌落边缘平整有同心环出现。然后挑处50个单菌落的菌株到显徼镜上观察，有20株孢子褐色至黑色，菌丝特点为：初丝为自色，菌丝较长，呈绒毛状；基内菌丝透明，有横隔；部分菌丝特化的壁厚、膨大的足细胞，顶囊明显膨大，多成球形。表面生辐射壮小梗，顶端分生孢子串生，如图。根据曲霉属分群检索表或参照相关文献可初步判断所筛选到的菌为黑曲霉。图 黑曲霉菌落形态与孢子茵丝结构特点3.2 黑曲霉的初筛由于初筛培养基中加有溴甲酚绿指示剂，黑曲霉产柠檬酸与之反应，在菌落周围形成一个透明的变色圈。一般认为，变色圈与菌落直径比例越大，菌株的产酸能力越强。这是因为透明的变
9、色圈是柠檬酸与溴甲酚绿反应的结果，故透明变色圈与菌落直径比例大的菌株相对而言代谢旺盛、产酸能力强.3.3黑曲霉的复筛通过发酵培养测定所选菌株的产酸量如下表： 测量菌落序号 变色圈与菌落直径之比耗 NaOH 体积V（ml)空白耗 NaOH体积 V（ml)产酸量（g)1 2.1 0.5 0.7 0.0372 2.5 0.8 1.2 0.047 这次实验验证了土壤中黑曲霉菌株产柠檬酸的能力。通过对整个实验的把握、计划以及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致计划和了解，缺少对时间的合理安排。对实验出现的可能结果缺少提前的预测和分析，导致当出现结果差异的时候不知道如何在进行接
10、下来的实验，缺少对问题的深入分析和理解。导致实验误差大，菌种培养率低，污染严重。最终经过查询资料得知透明圈的大小不能完全代表酶活力的强弱，其原因可能是：在倒平板的过程中，平板的厚度不均一，单位面积所含的菌种也不尽相同，另外平板培养和液体发酵的条件不同，得到的菌种产酸量大小也不会完全一致。参考文献：【1】胡立明，谢宇，等.黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的研究【J】河南工业大学学报2007，28(1)：7l-74 【2】减晋，刘凤霞，李永祥等高产醋酸菌的分离选育【J】 中国酿造1999，(5)：20-22【3】邓建珍韦红群等黑曲霉菌株产菊粉酶菌株的筛选及培养条俘的研究【J】 生物学杂志200724(6)：26-28【9】黄秀梨微生物学实验【M】 北京：高等教育出版社20003 3.0 1.2 2.0 0.0654 2.8 1.1 1.5 0.059
