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1、1新型重组人肿瘤坏死因子在小鼠体内的药代动力学作者：赵宁张英起王增禄高连用顾以保李全胜蔡永明曾勇陈拯民刘昌孝【关键词】肿瘤坏死因子 关键词:肿瘤坏死因子 ;药代动力学;放射测量术;小鼠摘要:目的研究新型重组人肿瘤坏死因子（nrhTNF）在小鼠体内的药代动力学.方法采用 125I 标记的 nrhTNF 同位素法，观察 im 和 iv 后的体内过程.结果按 10，20 和 40gkg-13 个剂量给小鼠 imnrhTNF 后在 12h 达到峰浓度，总放射性在体内消除较快，t1/2 为 4.76.5h，所得结果均证明 Cmax和 AUC 与剂量呈显著相关（r=0.95） ，与 iv 给药（10gkg
2、-1）的血药浓度进行绝对生物利用度试验，其 im 给药生物利用度为 0.803.nrhTNF 在体内的分布以肾含量最高，脑浓度最低，但都低于同时间的血药浓度.按10gkg-1im 给药后，用 RA 法测定尿和粪 24h 放射性总量，尿中放射性回收率为 86.8%，粪中回收率为 9.5%，总排泄量达给药剂量的 96.3%.结论nrhTNF 在小鼠的体内代动力学符合二室模型.Keywords:tumornecrosisfactor;pharmacokinetics;radiom-etry;miceAbstract:AIMTostudythepharmacokineticsofnewre-combi
3、nanthumantumornecrosisfactoralpha（nrhTNF）inmice.METHODS125IisotopelabellednrhTNFmethodswereused.RESULTSnrhTNFcanrapidlyenterintobloodcirculationafterthemicearegivennrhTNFimin10gkg-1，20gkg-1and40gkg-1inthenitreachedthepeakconcentrationin12h，t1/2was4.76.5h.There-sultsfromthethreedosesdemonstratethatCm
4、axandAUCarerelatedtodosessignificantly.TheabsolutebioavailabilityofnrhTNFgivenimwas0.803，comparedwithbloodconcen-trationsobtainedbyivin10gkg-1.ThelevelsofnrhTNFinbloodrankedfirst，kidneysecond，andbrainlast.Afterthemiceareinjectedimin10gkg-1，86.8%radioactivityisrecoveredfromurine，9.5%fromfeces，totaldi
5、schargeamountisupto96.3%oftheamountgiven.CONCLUSIONThepharmacokineticofnrhTNFinmicecouldbeappliedtotwocompartmentmodel.0 引言TNF 已经得以广泛研究和应用1-9.用基因工程技术生产的重组人 TNF-显示出与天然 TNF 相同的体内外抗肿瘤活性10.但因其毒性太大11 ，未被FDA 批准上市，因此各国都在研制 TNF 衍生物，以降低毒副反应.本中心研制了一种新型重组人肿瘤坏死因子（nrhTNF）.我们在药效学研究的基础上，参考nrhTNF 在小鼠药代动力学的研究文献12-15
6、 ，采用 125I 标记 nrhTNF 的放射性同位素法（RA）进行了 nrhTNF 的小鼠药代动力学研究.21 材料和方法1.1 材料 nrhTNF 为本中心制备，经 HPLC-GFC 分析，纯度为 97.5%.FT-630型 计数仪购自北京核仪器厂.昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量 1822g，由天津药物研究院动物室生产并提供.125I-nrhTNF 的制备采用 Iodogen 法进行nrhTNF 的 125I 标记.使用 sephacylS-200 凝胶色谱柱分离纯化 125I-nrhTNF，测定放射浓度为 1.48109BqL-1，放射比活性为1.59109Bqmg-1，放射化学纯度在 9
7、5%以上.1.2 方法放射活性测定法（RA 法）按文献15进行.2 结果2.1 总放射性浓度 3 组小鼠按 10，20 和 40gkg-1125I-nrhTNF剂量给药，im，另一组小鼠按 10gkg-1125I-nrhTNF 剂量给药，iv，分别于 0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，16，24h，由眼眶采血，分离血清，取血清 20L 置于测定管中，进行放射性测定.每时间点取 6 只小鼠，3 雌 3 雄（Fig1）.可见肌注给药组吸收迅速，各时间点的总放射活性与给药剂量相关.将相同剂量（10gkg-1） 、不同给药途径（im 和 iv） 、不同时间的总放射活性进行比较，可见
8、，给药 2h 后，两种途径给药的总放射性变化趋势基本一致.图 1 略2.2 药代参数将 Fig1 的实验数据用 3P87 药代计算程序进行数据处理，不论静脉还是肌肉给药，均以二室模型拟合药物浓度“-”时间曲线为适宜，自动计算出药代参数，肌肉给药的 t1/2 在 0.190.33h 范围，t1/2 在 5h 左右，Tpeak 在 1h 左右，Cmax 和 AUC 均随剂量的增加而增大，呈现明显的剂量相关（r=0.95，Tab1）.由肌肉和静脉给药的浓度数值经统计矩计算得到的 AUC 来计算出 nrhTNF 的绝对生物利用度为 0.803.2.3 组织分布按 10gkg-1 剂量给小鼠用药，im，
9、0.1mL/只（含125I-nrhTNF1.85104Bq/只） ，给药前 20min 给 NaI0.2mL（含 NaI20mg，ip）.给药后 0.5，1，2，4，8h 处死动物，取脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉、脂肪、卵巢、子宫、睾丸和血液，每一脏器取样 100mg（不足 100mg者，记录实际质量） ，分离血清，取 20L 置于测定管中，进行总放射活性计数，再根据校正曲线计算出每克组织放射活性，每时间点取样 6 只动物，3 雌 3 雄.在给药后 0.5h，放射活性从高到低的顺序为血液、肾、肺、肝、小肠、肌肉、胃、心、脂肪、脾、卵巢、睾丸、子宫和脑;给药后 8h 仍能测到放射活性，
10、其分布顺序为血液、肾、肺、肝、胃、肌肉、脾、心、小肠、脂肪、睾丸、子宫、卵巢和脑（Fig2）.表 1 总放射性测定的 nrhTNF 药代参数略3图 2 略2.4 排泄实验小鼠 4 只，2 雌 2 雄，按前法用 NaI 处理，给予nrhTNF10gkg-1（含 125I-nrhTNF1.85104Bq/只，im）放入代谢笼内，收集 0-2，2-4，4-8，8-12，12-24h 的尿样和粪样.取尿样置于测定管内，用 -计数器测定放射活性，结果从累计放射量来看，给药后 2h 由尿排泄约为给药剂量 50%的放射量，给药 24h 排泄 86%的放射量，表明 125I-nrhTNF 主要是由尿排泄（Fi
11、g3）.将收集到的粪样制成匀浆后测定不同时间段的放射活性（Fig3） ，24h 累计粪排泄量为所给剂量的 9.5%，而且主要是给药后 8h 内排泄的.图3 略3 讨论Ferraiolo 等12给小鼠肌注 rhuTNF320gkg-1 后 1h 血清浓度最高，可达 112gL-1，给药后 4h，肌注与静脉给药的血清rhuTNF 浓度变化趋势基本一致，在静脉给药后 t1/2 为 19min，t1/2 为2.7h，nrhTNF 的 t1/2 为 0.26h，t1/2 为 3.13h，均较 rhuTNF 时间略长.RA 法测定 125I-rhuTNFim 的血药浓度所得 t1/2 显著大于 ELISA
12、 测定的结果，t1/2 长达 811h.我们应用 RA 法测得的 nrhTNFt1/2 也较长，达 5h 以上.从组织分布试验结果可见，放射性活性主要分布在血液、肾、肝、肺和小肠中，而且随着时间变化排列顺序有所变化，肺中浓度由 0.5h 的第 3 位降到 1.0h 到4.0h 的第 4 位，到 8.0h 时又上升到第 3 位.说明 nrhTNF 在肺内代谢相对肝中较慢，这可能也是对 nrhTNF 治疗实验性肺癌效果较好的一个佐证.多肽和蛋白质类药物的失活和消除机制十分复杂，许多组织都是潜在的分解代谢和消除部位.本实验结果表明，肾脏是 nrhTNF 最重要的消除器官，nrhTNF 主要经肾由尿排
13、泄，im 给药后 24h 内，从尿中回收到给药总量的 86.8%，从粪中回收到给药总量的 9.5%.从粪中回收到的这部分可能与分布到胃肠的药物有关，尿粪 24h 的总回收率达到 96.3%，说明本品的排泄消除去向已较清楚.而且排泄快而完全.致谢第四军医大学基础部免疫学教研室金伯泉教授，刘雪松，李琦和杨琨的帮助.参考文献:1ZhangJY，ZhangDZ，WangCJ，ChenNC，SuCZ.Construc-tionofahighactivemutantoftumornecrosisfactoranditsex-pressioninE.coliJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（J
14、FourthMilMedUniv） ，1997;18（Suppl）:4-8.2XuP，YiDH，ChenP，WangHS，HouXB.Expressionandlo-calizationofTNF-mRNAingastricmucosaofCPBrabbitJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，2000;21（5）:636-639.3SpeiserW，KapiotisS，KoppCW，SimonitschI，JilmaB，JansenB，ExnerM，ChottA，RelatedA.Effectofintradermaltumornecrosi
15、sfactor-alpha-inducedinflammationoncoagulationfactorsindermalvesselendothelium.Aninv4ivostudyofhumanskinbiopsiesJ.ThrombHaemost，2001;85（2）:362-367.4GuoZ，HuYY，LuR，WangJ.ThemodulationofBMPonex-pressionofTNF-andIL-6geneintheareaofimplantedxeno-geneicboneJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，2000;
16、21（1）:41-44.5MysliwskiA，BigdaJ，KoszalkaP，SzmitE.SynergisticeffectoftheangiogenesisinhibitorTNP-470andtumornecrosisfactor（TNF）onBomirskiAbmelanomainhamstersJ.AnticancerRes，2000;20（6B）:4643-4647.6ZhangJY，ZhangDZ，WangCJ，ChenNC，SuCZ.Highex-pressionofhumantumornecrosisfactorinE.coliandpurifica-tionoftheexpressedprodactJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv） ，1997;18（Su
