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1、1幽门螺杆菌 cagA 基因对胃癌细胞影响【关键词】幽门螺杆菌；CagA；细胞增殖；细胞凋亡摘要：目的观察幽门螺杆菌（Hp）野生株与 cagA 基因同源缺失突变株对人胃癌细胞株 BGC823 的细胞增殖和凋亡的影响，探讨与 Hp 毒力基因 cagA 相关的细胞水平的毒性效应。方法将幽门螺杆菌野生株与 cagA 基因缺失突变株与BGC823 细胞共培养，分别在 6，12，24 和 48h 观察细胞形态学变化，采用四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果野生株和突变株 Hp 攻击 BGC823 细胞 6h，即可引起细胞的形态学变化，48h时均可观察到细胞形
2、态呈分散及蜂鸟样改变（细胞拉伸） 。MTT 法检测显示，野生株对 BGC823 细胞增殖具有抑制作用，而缺失 cagA 基因的突变株可刺激细胞增殖，且在 24，48h 的 2 个时间点上均高于对照组和野生株组（P005） 。流式细胞分析显示，在攻击 BGC823 细胞 48h 后，野生株和突变株均可引起细胞凋亡，凋亡率高于对照组（P005） ，2 个实验组的凋亡率差异无统计学意义。结论Hp 作用后细胞呈分散和蜂鸟样改变（伸长）并不是 cagA 基因特有的细胞学效应；cagA 基因是 Hp 抑制细胞增值所必需的元素；cagA 基因的有无对 Hp 致凋亡效应的影响不大，在 Hp 致细胞凋亡的效应中
3、作用可能有限。关键词：幽门螺杆菌；CagA；细胞增殖；细胞凋亡EffectsofcagAgeneofhelicobacterpylorionBGC823cellsAbstract:objectiveToobservetheeffectsofacagA-deletedmutantstrainofChineseH.pylorionthephenotypes,proliferationandapoptosisinhumangastriccancercelllineBGC823invitro,andtodeterminethecytotoxicityofcagA,oneofthevirulencege
4、neofH.pylori.MethodsBGC823cellswereco-culturedwiththewildtypeH.pyloriandtheisogenousmutant,whichwerecalledthewildtuestraingroupandthemutantstaingroup,respectively.Thecellphenotypewasobservedat6,12,24and48handthecellularproliferationwasexaminedbymethylthiazolyltetrazolium(MTT)method.Theinductionofapo
5、ptosiswasdeterminedbyflowcytometry.ResultsThechangesofcellmorphologywereobservedwhenBGC823cellswereco-culturedwithH.pylorifor6hours,andcellscatterringandhummingbirdmorphology(cellelongation)werepresentedafterco-culturedfor48hoursinbothgroups.TheMTTassayshowedthattheviabilityofBGC823cellswasinhibited
6、inthewildtypestraingroup,whilewassignificanthigherinthemutantstraingroupthanthatofthecontrolgroupandthewildtypestraingroupwhenco-culturedwithH.pylorifor24and48hours,respectively.Asdemonstratedbyflowcytometry,theapoptoticrateinboththewildtypeandthemutantgroupwashigherthanthatofcontrolgroup(P0.05),but
7、therewasnodifferencebetweenthetwogr2oupstreatedwithH.pylori.ConclusionsCellscatterringandhummingbirdphenotype(cellelongation)werenotthecellmorphologycharacteristicsspecificrelatedtothecagAgeneaftertreatedwithH.pylori;ThecagAgenemayplaythecrucialroleinH.pylorisactionsofinhibitingcellularproliferation
8、;ThecagAgenemayhavetheonlylimitedeffectsonthecellularapoptosisinducedbyH.pylori.Keywords:helicobacterpylori;cagA;cellproliferation;apoptosis幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一种可长期定植于人类胃粘膜的革兰阴性微需氧菌，在全世界范围内感染率超过 50%。Hp 是引起萎缩性胃炎和胃溃疡等慢性炎症的致病因子，流行病学和动物实验证实，Hp 慢性感染是导致胃癌的重要危险因素，世界卫生组织已将其列为一类致癌原1 。然而 Hp 确切的致癌机制至
9、今仍不清楚。细胞毒素相关基因 A 蛋白(cytotoxinassociatedgeneA，CagA)是 Hp 重要的毒力因子之一。流行病学研究认为，CagA 阳性 Hp 感染与消化性溃疡和胃癌发生的关系比 CagA 阴性菌株更为密切，提示 cagA 在 Hp 致病过程中可能具有重要作用2,3 。世界范围内不同Hp 菌株 CagA 分子变异较大，该变异可能导致不同菌株的 CagA 生物学作用乃至致病性不同4 。我国作为 Hp 感染较严重的国家之一，临床分离株中超过 90%含有 cagA 基因，但对于毒力因子 CagA 的生物学功能不甚明了。另外，由于cagA 阳性野生株与 cagA 阴性自然突变
10、株之间缺乏除 cagA 基因以外的相同遗传背景，所以无法对 cagA 基因功能做出真实判断。为此，本室在自行构建的幽门螺杆菌中国株 cagA 基因缺失突变株的基础上，探讨野生株与突变株对人胃癌细胞株 BGC823 细胞增殖和凋亡的影响，旨在揭示与 Hp 毒力基因 cagA 相关的细胞水平的毒性效应。结果报告如下。1 材料与方法11 材料（1）菌株与细胞株：幽门螺杆菌野生株 MEL-Hp27(Hp27)为本教研室从郑州市慢性萎缩性胃炎患者体内分离并保种（cagA+） ；cagA 基因缺失突变株MEL-Hp27cagA 为本室自行构建，cagA 基因被完全敲除掉，代之以卡那抗性基因；低分化胃癌细胞
11、株 BGC823 细胞由郑州大学第一附属医院周慧聪博士惠赠。（2）试剂与仪器：四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)（华美生物工程公司） ；FTTC-AnnexinV/PI 标记液（北京宝赛生物技术有限公司） ；紫外分光光度计（日本HITACHI 公司） 。酶标仪（美国 BioRad 公司） ；流式细胞仪（美国BectonDickinson 公司） 。12 方法121Hp 的培养将野生株 MEL-Hp27 和突变株 MEL-Hp27cagA 分别接种于含10羊血的布氏平板培养基（含万古霉素 10mgL、多粘菌素B2500UL、TMP5mgL、两性霉素 5mgL） ，37、微需氧条件下（10CO2，5O2，
12、85N2）培养，3d 后收集细菌，用 PBS 制成细菌悬液，在分光光度计上测定细菌浓度（1A660=1108CFU/ml） ，然后用含 10胎牛血清的无抗生素 RPMI-1640 培养液调整适当浓度用于攻击细胞。3122BGC823 细胞培养 BGC823 细胞的培养基为含 10胎牛血清的无抗生素RPMI-1640 培养液，细胞置于 37含 5CO2 的培养箱中常规培养。123BGC823 细胞与 Hp 共培养 BGC823 细胞于 37含 5CO2 的培养箱中培养，24h 后换用含 Hp 的细菌悬液，置于 37微需氧环境中共培养；对照组只含 10胎牛血清的无抗生素 RPMI-1640 培养液
13、；野生株组和突变株组细菌与细胞的比例均为 1001。124 细胞形态学观察 BGC823 细胞以 1104 个/孔接种于 24 孔板中，分别于细菌与细胞共同培养的 6，12，24，48h 对细胞形态进行观察。125 细胞增殖测定采用 MTT 法，细胞以 5103/孔密度接种于 96 孔板上，每组设 6 个复孔，分别在细菌与细胞共培养的 12，24，48h 于每孔加入MTT20l，置 37、5%CO2 培养箱继续培养 4h 后，弃孔内培养上清液，每孔加入 DMSO150l，室温避光摇床上充分振荡 10min，在酶标仪上测定各孔 A492nm吸光度(A)值并记录结果。126 细胞凋亡测定细胞以 5
14、105/孔的密度接种于 6 孔板上，置于 37含5CO2 的培养箱中培养，24h 后换用含 Hp（5107/孔）的细菌悬液，置于 CO2培养箱中共培养。在细胞与细菌共培养 48h 后，胰酶消化细胞，1000r/min 离心10min,收集细胞,冷 PBS 洗 3 遍，以 FTTC-AnnexinV/PI 双标记后,流式细胞仪检测，该方法能区别凋亡细胞和坏死(PI 标记)细胞。2 结果21 细胞形态学（图 1）图 1 可见，人胃癌细胞 BGC823 株经野生株和突变株Hp 攻击后，均出现明显的形态学变化，并随 Hp 与细胞共培养时间的延长，细胞形态学变化越明显。对照组细胞贴壁生长良好，轮廓清晰，
15、呈多边形，胞质内颗粒较少。而野生株和突变株 Hp 攻击细胞 6h，即可见细胞周边有较多细菌附着,细胞有脱壁现象，培养液中可见细胞崩解后的残留颗粒或菌体；培养 48h 后，可见细胞形态呈分散及蜂鸟样改变（细胞拉伸） 。图 1Hp 与细胞共培养各时间点细胞形态学变化（略）22 细胞增殖活性(表 1)表 1 可见，在 Hp 与细胞共培养的 12h，野生株和突变株组细胞的增殖活性与对照组相比差别不大；培养 24h 时各组细胞增值活性差异有统计学意义（F=55431，P=0000） ，其中突变株组细胞增值活性明显高于野生株组（P=0000）和对照组（P=0000） ，野生株组细胞增值受抑制，明显低于对照
16、组（P=0000） ；培养 48h 时各组细胞增值活性差异仍有统计学意义（F=7228，P=0003） ，两两比较显示，突变株组细胞增值活性高于野生株组（P=0001）和对照组（P=0042） 。表 1Hp 与 BGC823 细胞共培养不同时间点的 MTT值（略）4注:与对照组比较,*P0005；与对照组及野生组比较,*P00523 细胞凋亡率（图 2）以 100:1 的细菌与细胞比例共培养 48h 后,流式细胞仪分析显示，野生株组和突变株组细胞凋亡率分别为 843%和 913%，均高于对照组凋亡率 273%（P005）,但 2 组差异无统计学意义。图 2 各组凋亡率比较（略）3 讨论由于 Hp 菌株自身的变异，cagA 阳性株与 cagA 阴性株间除 cagA 基因外存在许多差异，在自然状态下很难对 cagA 基因功能做出真实判断。为此，本室自行构建了幽门螺杆菌中国株 cagA 基因缺失突变株，并在此基础上观察了遗传背景相同的野生株与突变株对人胃癌细胞株 BGC823
