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1、采用重叠PCR进行定点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。而采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。该技术主要包括以下几步：设计引物，PCR扩增基因两端，回收两端片段，两端片段退火延伸，扩
2、增全长基因。1. 引物设计重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5端，尽量避免出现在3端。2. 分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。3. 分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。4. 将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。5. 取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。
