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1、实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球
2、状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。1细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同
3、时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。表 凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特等，2001）方法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存无限制略带主观性，但可靠Hoechst染色不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化乙锭不限极快，不能贮存凋亡初期可用，略带主观性，但可靠FACS/FSCXSSC非贴壁细胞简单，须及时进行客观，仅能提示凋亡FACS/PI吸收非贴壁细胞简单，需及时进行客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋白V(锚定蛋白)最好非贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响；
4、测定已知的显著性 的反应DNA片段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适用DNA片段(PI染色)不限很快，低廉定量；用于估计凋亡程度DNA片段(JAM分析)循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能用于所有细胞TUNEL不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损失不限低廉，快速不能确定凋亡，并非次生坏死前的所有细胞都适用caspase活化(蛋白酶活性)不限中等花费，很快目前不能确定凋亡，但适用于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹)不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；
5、依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹)不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。（2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。（3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。（4）吖啶橙(A()溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正
6、常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。（5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。（6）苏木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变
7、化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定：细胞凋亡时，Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡核小体，各核小体
8、的DNA与核心组蛋白H2A，H2B，H3，H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。可通过ELISA进行检测，主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。该法敏感性高，不需要特殊仪器，可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。TUNEL法： 细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeo
9、xynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。流式细胞仪定量分析：流式细胞术（flow cytometry）是20世纪70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞特征及细胞或细胞器的组成进行快速
10、定量分析与分选的一门技术。流式细胞仪由液流系统（鞘液室、废液箱、鞘液管、样本管、压力系统、流动室或喷嘴）、光学系统（激光光源、透镜、滤片）、电子系统（光电倍增管、信号放大器）、计算机系统以及分选系统等组成。当经过荧光染色样品悬液注入样品室、不含样品的鞘液注入鞘室后，两种液体被高压推动从喷嘴一起喷出，由于动力学原理，单个样品被鞘液包裹，排列成束并高速运动。随后样品束与激光器产生的激光束呈90垂直相遇，激光使样品产生荧光和各个方向的散射光，信号检测器的阻断滤片和双色反射镜可以除去激发光，仅让需要的荧光通过，光电倍增管对荧光进行检测并将荧光转化为电信号。各种散射光中，前向角散射光（forward l
11、ight scatter，FSC）（与激光夹角0.52）和垂直角散射光（side scatter，SSC）（与激光束夹角90）与样品含有的颗粒数量有关，散射光检测器可以对这两种光进行检测。每个样品颗粒所产生的荧光和散射光通过检测器时均能被测定，如果对荧光或散射光设定一定分选值，控制系统可以将每一个颗粒所产生的荧光和散射光强度与该值进行比较，并决定对该液滴充以正电荷、负电荷或者不充电。在高压偏转电场中，带有不同电荷或不带电荷的样品颗粒具有不同的运动轨迹，从而被收集到不同的容器中。流式细胞仪可在短时间内对成千上万的样品进行分析，分离准确率达到99%以上。细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是
12、其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，用荧光素染被检测细胞悬液，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。如：检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法就是利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoechs染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。2细胞凋亡的诱导因素诱导凋亡的因素包括物理因素、化学因素以及生物因素：物理性因子：包括射线(紫外线，射线等)，较温和的温度刺激(如热激，冷激)等。化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细
13、胞生长因子，肿瘤坏死因子a(TNFa)，抗FasApo-1CD95抗体等。而过氧化氢(H2O2)、醋酸、高渗透压和高盐浓度等均可以诱导酿酒酵母的凋亡，葡萄糖是酿酒酵母生长所必须的重要营养物质之一，但在其他营养元素缺乏的条件下，只用葡萄糖培养也可迅速的诱导酿酒酵母的细胞凋亡。【实验目的】通过不同诱导物或同一诱导物不同诱导时间对细胞凋亡诱导的影响研究，使学生进一步了解细胞凋亡的机制及生物学意义；了解细胞凋亡的诱导和检测方法；初步掌握实验方案设计、数据整理及结果分析和论文撰写等基本技能。【实验器材、材料和药品】1器材超净工作台、离心机、天平、荧光显微镜、振荡培养箱、CO2培养箱、电泳仪、电泳槽、流式
14、细胞仪、注射器、试管等。2试剂及其配制MS培养基2,4-D1DAPI血清DMEM培养基YPD培养基、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)的PBS溶液Giemsa染液磷酸盐缓冲液(PBS)琼脂糖TAE 【实验方法和步骤】1查阅资料，选题由教师提供课题，学生选定研究课题；或由学生查阅资料、根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的以小组为单位，自行命题，报教师审批。选择诱导凋亡的因素和受体材料。2查阅资料，灵活运用所学知识和技能设计实验根据选择的课题，利用图书馆、网络等资源广泛查阅资料，经充分讨论后设计出实验方案，设计实验方案包括确定诱导条件（如诱导剂的浓度、诱导时间等）、确定合适的凋亡检测方法和步骤。将实验方案交教师审阅、修改、完善，经教师审批后方可实施。3实施并完成自行设计的实验根据实验设计技术路线，进行实验前的准备工作，实验用复杂溶液配置可在老师指导下配置，实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。并做好实验记录，向教师报告实验情况和结果，经教师批准后方可结束实验。4分析实验结果，写出实验报告分析讨论实验结果，得出实验结论，并以小论文格式书写实验报告，内容包括摘要、前言、材料与方法、实验结果、讨论、参考文献等几部分。【作业与思考题】1如何区分细胞凋亡和细胞坏死？2以小论文形式撰写实验报告。
