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1、(拟终审修改稿 稿件编号：201211069)一株反硝化细菌的分离鉴定及其反硝化特性杨浩锋1，唐佳玙1，胡安辉1，杨岳平*1，谢柳2(1.浙江大学环境工程系，杭州310058；2.湖州环境科技创新中心，湖州，313000)摘要：从处理城镇污水的移动床生物膜反应器中分离获得一株反硝化细菌D3，并进一步研究该菌株的系统发育地位及反硝化特性。采用16S rDNA序列分析对菌株进行初步鉴定，探讨了基质浓度、起始pH和温度对菌株反硝化活性的影响。根据形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列测定分析，初步鉴定菌株属于寡养单胞菌属。该菌能利用硝酸钠或亚硝酸钠进行反硝化作用，最佳电子受体是硝酸盐氮，反硝
2、化速率最大为19.86 mgL-1h-1，最适生长pH为7.36，最适生长温度为33.5。菌株D3在初始硝态氮浓度为140mg/L，以乙酸钠为唯一碳源，pH为7.36，温度33.5的最优生长条件下，培养10h进入对数生长期，倍增时间为9.9h，48h内硝酸盐还原率达95%。关键词：生物脱氮；反硝化细菌；StenotrophomonasIdentificationand denitrification characteristicsofa denitrifier(Yang Haofeng1，Tang Jiayu1，Hu Anhui1，Yang Yueping基金项目：浙江省科技计划项目（2009
3、C03005-4）和浙江省公益性技术应用研究计划（2011C33G2010245）（Supported by the scientific and technological planning project of Zhejiang province(2009C03005-4), by the public benefit technology application research planning of Zhejiang province(2011C33G2010245)）作者简介：杨浩锋（1988-），男，硕士研究生，研究方向为废水生物处理技术。E-mail:通讯作者：Tel: +86
4、-571-8898-2036； Email: 收稿日期： ；修回日期：1，Xie Liu2)（1.Department of Environmental Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China2.Huzhou Environmental Science and Technolohy Innovation Center，Huzhou 313000，China）Abstract:A denitrifier named D3 was isolated from a moving bed biofilm reactor treatin
5、g municipal wastewater.16S rDNAsequence was analyzed to identify the strain.Effects of substrate concentration, pH and temperature on the denitrification activity of the strain were studied in the batch culture.Strain D3 was identied as Stenotrophomonas sp. through morphologicalfeature,biochemical/b
6、iophysical characteristicsand 16S rDNA sequence analysis.Strain D3was able to use either sodium nitrate or sodium nitrite as electron acceptor to oxidize organic matter. The maximum denitrification rateby using nitrateas electron acceptorwas 19.86 mgL-1h-1, which is much higher than that of nitrite(
7、4.05 mgL-1h-1). Therefore, the optimal electron acceptor was nitrate. Growth dynamics test revealed that the optimal pH andtemperature for D3were 7.36 and 33.5, respectively.Under the optimal conditions (NO3-N 140mg/L, acetate served as sole organic carbon source, pH 7.36 and 33.5), strain D3inthe e
8、xponential phasewas obtained after 10h, and the doubling time was 9.9h.The nitrate removal efficiency was up to 95% in 48 hours.Keywords: biological nitrogen removal;denitrifier; Stenotrophomonas近年来，含氮工业废水的排放以及农业过量施用化肥，导致硝酸盐、亚硝酸盐等含氮化合物污染地下水，危害饮用水水质1。含氮废水进入水体引发的水质恶化及富营养化问题日趋严重，氮素污染亟待解决。生物反硝化即利用反硝化菌的作
9、用，将硝酸盐氮（亚硝酸盐氮）转化为气态产物脱除，被认为是最经济有效的脱氮方式2。而异养反硝化菌在反硝化作用中占主要地位，迄今为止，国际上已分离到多种反硝化微生物，主要有Alcaligenes，Aquaspirillum，Azoarcus，Bacillus，Pseudomonas，Paracoccous，Thauera等3-5。本研究从移动床生物膜反应器(MBBR)中填料生物膜上分离、筛选得到1株反硝化菌株D3 ，并根据其形态学特征、生理生化特性和部分长度的16S rDNA序列，确定分离菌株的系统发育地位，为今后利用微生物强化治理氮素污染提供了菌种来源。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要
10、试剂和仪器：用于DNA提取的BS423试剂盒、琼脂糖购于上海生工生物工程有限公司；引物与PCR试剂盒购于Takara（大连Takara），其他试剂购于国药集团化学试剂有限公司。UV-2102紫外分光光度计（UNIC）；HZ-9310K恒温摇床（华利达）；MJ MiniPCR仪（Bio-rad，美国）；Leica DFC300显微镜；3k15台式高速冷冻离心机（Sigma）；SPX-250B-Z生化培养箱（上海博讯实业有限公司）；JEM-1200EX透射电子显微镜（JEOL，日本）。1.1.2 反硝化培养基（g/l）：CH3COONa 2.0，NaNO3 1.0，K2HPO4 0.5，MgSO4
11、 7H2O 0.2，微量元素2ml， pH 7.27.6。其中微量元素溶液（g/l）：EDTA 2.06，FeSO47H2O 1.54，MnCl24H2O 0.2，ZnSO47H2O 0.1，CuSO45H2O 0.02，Na2MnO4 0.1，CoCl26H2O 2 mg。1.2 菌株分离和筛选反硝化细菌D3菌株从连续运行的MBBR反应器中填料生物膜上分离获得。取污泥样品系列稀释后用液体培养基富集反硝化细菌，选择稀释度最高的阳性培养液进行平板涂抹及划线法分离目标菌株。经多次划线纯化后，挑取单菌落至反硝化菌培养基中，30恒温培养3-5天，定期观察产气情况并测定硝氮含量，从而筛选出高活性反硝化菌
12、株，并鉴定其菌落、形态特征。1.3菌株鉴定菌体形态学研究：对菌体进行革兰氏染色，在显微镜下观察染色结果并拍照。菌体内部结构研究：对菌体进行超薄切片，用JEM-1200EX透射电子显微镜观察菌体内部结构。分子生物学鉴定：菌株DNA提取方法参照BS423试剂盒，试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。菌株16S rDNA的PCR扩增采用细菌通用引物（27f：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，1492r:5-GGYTACCTTGTTACGACTT-3）。PCR反应体系为50ul，即DNA模板3ul，10*buffer 5ul，dNTP混合物(各2.5mmolL-1)4ul，正向引物(10
13、pmolL-1)1ul，反向引物(10pmolL-1)1ul ，Taq DNA聚合酶0.3ul，超纯水 35.7ul。PCR反应条件为：94预变性5 min，94变性1 min，50退火1 min，72延伸3min，进行30个循环，72延伸7 min。将获得的PCR产物纯化后委托Takara公司测序。1.4 菌株的生长特性实验1.4.1 生长动力学：分别以NaNO3和NaNO2为氮源，考察菌株生长及脱氮能力。实验在110 ml血清瓶中进行，瓶中加入50 ml反硝化培养液，2 ml菌液，其中NO3-N和NO2-N浓度依次设定为70, 140, 210, 280, 350 mg N/l，初始pH值
14、控制在7.5，在30下恒温摇床培养，通过测定NO3-N和NO2-N浓度变化来判断菌株的反硝化能力，以不加菌株的血清瓶作为对照，每个实验做3个重复。1.4.2 菌株最适生长pH：在110 ml血清瓶中加入50 ml反硝化培养液，2 ml菌液，其中NO3-N浓度设定为140 mg N/l，初始pH值依次控制在6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0，在30下恒温摇床培养，通过测定OD600来判断菌株的生长情况，以不加菌株的血清瓶作为对照，每个实验做3个重复。1.4.3 菌株最适生长温度：实验设计同1.4.2，初始pH值控制在7.5，温度依次设定为20，30，35，40，45。1.5 分析方
15、法NO3-N：紫外分光光度法6；NO2-N：(1-萘基)-乙二胺分光光度法6；细菌生长量：以OD600表示7。2 结果与讨论2.1反硝化菌的分离和筛选经过多次分离纯化，共获得6个反硝化菌株，分别编号为D1-D6，,这些菌株都具有反硝化活性，且菌株D3和D6在第3天时于试管中观察到大量气泡产生，培养3d后各试管NO3-N含量变化如表1所示，其中D3菌株活性最强，以下试验均以D3菌株为材料。表1 各菌株培养3d后NO3-N含量变化比较Table 1 Comparsion of nitrate nitrogen concentration changes after 3 day cultivationStrain D1D2D3D4D5D6NO3-N/mgL-163.02136.8516.57133.15155.9961.59NO3-N removal efficiency/%61.7516.9389.9419.185.3262.612.2菌株的鉴定2.2.1 菌株的外部形态特性：D3菌株的菌落呈浅黄色，圆形，表面光滑湿润。用Leica研究显微镜观察发现，D3菌株为杆菌，大小为(0.60.8)m(1.21.4)m，革兰氏染色反应呈阳性，菌体染色后的光学显微镜照片见图1。图1 D3菌株的菌体
