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1、信,析,浅,肽,号,Endoplasmic reticulum,secretion,Golgi complex,Cell membrane,不同类型蛋白质在细胞质合成后如何转运到应该去的部位?,分选信号引导蛋白质到达正确的地点,信号肽peptide signal：蛋白质多肽链上的一段连续的特定氨基酸序列，具有分选信号的功能。可位于多肽链的任何部位，完成分选任务后常被切除。,分选信号有两类,2.信号斑plaque signa ：位于多肽链不同部 位的几个特定氨基酸序列经折叠后形成的 斑块区，具有分选信号的功能。信号斑是 一种三维结构。完成分选任务后仍然存在。,分选信号引导蛋白质到达正确的地点,信
2、号肽,背景,发现,探索,延伸,1972年Milstein等发现 免疫球蛋白IgG轻链的前 体要比成熟的IgG在N-端 多 20氨基酸。他们推测这 20个氨基酸可能和其通过 ER进而分泌有关,Blobel从内分泌性蛋白质向内质网转运入手研究蛋白质转运的机制 ,发现了3条重要线索 : 1. 被转运蛋白质的初生肽(即其前身物)比成熟肽大 被转运的分泌性蛋白质进入内质网的过程与其生物合成的过程是平行进行的 3.信号肽在内质网内被切除。,信号 假说 (signal hypothesis),1999年度诺贝尔生理学或医学奖,信号肽之父,背景,信号肽,信号肽序列的特点,（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；
3、,分泌性蛋白质转运的信号假说：,AUG,SRP,SRP receptor,Signal peptidase,5 Cap,AAA3,ER lumen,Signal peptidase,ER membrane,Cytosol,Ribosome receptor,信号肽,信号肽捕获系统,将报告基因和蛋白表达基因插入载体，转染细胞，如果报告基因所表达的蛋白能得到分泌，那么此段蛋白表达基因中含有报告基因表达所需的信号肽。,蛋白表达基因,报告基因,载体基因,基因组DNA文库,筛选方法,使用文库,sue2- SST,系统分类,酵母细胞筛选系统(Y-SST):sue2- SST,用sue2作为报道基因构建粘粒
4、载RK18，插入胚胎 cDNA文库后转染酵母细胞YT455，用蔗糖进行筛选。 由于酵母YT455在蔗糖培养基中生长依赖于sue2基因编 码的蔗糖转换酶向细胞外的分泌，所以筛选的指标是： 酵母的存活与否。,信号肽捕获系统,哺乳动物细胞筛选系统(M-SST): Tac-SST,信号肽捕获系统,该系统以人IL一2RoL(hTac)为报道基因构建信号肽筛选 载体。其基本原理是，将待筛选的cDNA片段与hTac(信 号肽序列已被去除)的 5 端相连，得到的表达载体文库 转染COS-7，然后用抗Tac抗体鉴定能够将hTac表达在 细胞膜表面的克隆，从阳性克隆中得到插入的cDNA片 段，理论上这些cDNA片
5、段是能够编码信号肽的，这样就 实现了对分泌蛋白质的筛选。,哺乳动物细胞筛选系统(M-SST): SST-REX,该系统利用一种生长依赖IL-3存在的细胞系一BaF3进行筛 选。由于筛选是在哺乳动物细胞而不是酵母细胞中进行，所以 得到的信号肽的数量和可信度相对于suc2-SST要更高。该系 统是目前从cDNA文库中筛选信号肽编码序列最好的系统.,信号肽捕获系统,信号肽,TaKaRa相关产品-实验例：超耐热性酵素-glycosidase 信号肽筛选,B. subtilis Secretory Protein Expression System (Code No.3380) B.枯草杆菌分泌蛋白表达
6、系统,将目的基因(-glycosidase的DNA序列) 和173种B. subtilis来源的信号肽插入载体，先转染大肠杆菌，增殖获得质粒文库后,转染B. subtilis,获得分泌蛋白.,pBE-S DNA (5,938 bp),pUB ori,Kanr,ColE1 ori,Ampr,aprE promoter,aprE SP,Multi cloning site（MCS）,His-Tag,目的基因,将目的基因插入pBE-S DNA中,Mlu I Eco 52 I双酶切将 Plasmid线形化,使用In-Fusion 反应插入 SP DNA mixture,SP,转染 E. coli HS
7、T08,E.Coli Cell,37 ON,构建质粒文库,理想2000个菌落,本制品可获得1000个菌落,获得质粒文库,0.5ml,50ul,LB培养基,制备 B. subtilis 感受态细胞,37 16hr,LB培养液 2 mL,37 16hr 150-180rpm,LB培养液 2 mL,SP I mudium 5mL,SP II mudium 4.5 mL,37 90min 90-100rpm,37 170-180rpm,50 ul 100 mM EGTA,5-10 min 37 90-100rpm,形态转换,质粒文库,B.subtilis 感受态细胞,1 ug,300 ul,37 90min 90-100rpm,37 ON,按目的蛋白的特性进行筛选,荧光法 底物：4-甲基伞形酮,Barush 和Swiain 法 底物：水杨苷,比色法 底物：对硝基苯基-D-葡萄糖苷, ,-糖苷酶： 可以使糖苷或寡糖的糖苷键水解,新比色法 底物：京尼平苷,-糖苷酶的活性测定,随机选取470个克隆的培养上清进行-糖苷酶的活性测定,根据活性测定结果，挑选24个菌落进行精制，测序，结果表明分泌蛋白水平与信号肽有关。,信号肽,展望,1,2,3,4,医 疗 相 关,蛋白生产相关,细胞表面工程相关,其他相关,放飞思想 尽情展望,
