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1、实验三、水中细菌总数的测定,（平板混匀法）,我国饮用水标准,细菌总数主要作为判断被检水样污染程度的标志。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于37经24小时培养后，所生长的细菌菌落的总数。我国生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）中规定生活饮用水的细菌总数l ml中不得超过100 CFU (colony forming unit)。,一、实验目的 二、实验仪器与材料 三、实验操作步骤 四、实验结果 五、思考题,一、实验目的,掌握水样的取样方法； 掌握水体中细菌总数的测定方法； 了解国家的相关法规。,二、实验仪器与材料,1. 仪器： 高压蒸汽灭菌器、恒温箱
2、、冰箱、体视镜(放大镜)、带刻度试管（3）、培养皿（4）、微量移液器（配枪头）、三角瓶（2 ） 、计数器。 2. 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,三、实验操作步骤,1. 水样的采集 供细菌学检验用的水样，必须按一般无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送、贮存过程中不受污染。为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样在采取后应立即送检；一般从取样到检验不应超过4小时。条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验报告单上注明。,（1）自来水的取样方法,先将自来水龙头用火焰烧灼三分钟灭菌，然后再开放水龙头使水流5分钟，以排除管道内积存的死水，再用无菌容器接取水样，以待分析。如
3、水样内含有余氯，则采样瓶未灭菌前按每采500ml水样加3硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O)溶液lml的量预先加入采样瓶内，用以采样后中和水样内的余氯，以防止其继续存在有杀菌作用。,（2）待检水样的采集方法,可应用采样器，器内的采样瓶应先灭菌。采水样时，直接将水灌入已灭菌的采样瓶，不需再用样水洗采样瓶。采样后，采样瓶内的水面与瓶塞底部间应留有一些空隙，以便在检验时可充分摇动混匀水样。,2. 水中细菌总数的测定,（1）水样的稀释（梯度稀释法） 根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管作10倍系列稀释。具体步骤如下：取水样10ml，盛于有90ml无菌水的三角瓶内，充分振摇15分钟，此即为10-1浓度的
4、稀释液。静置15秒后，用无菌吸管取10-1稀释液2 ml加至18ml无菌水试管中，充分摇匀，此即为10-2浓度稀释液。另取无菌吸管，依次作10倍知释，制成10-3、10-4等一系列稀释液，通常稀释至10-6浓度。,10-2 10-3 10-4 10-5 10-6,10-1,（2）接种,以无菌操作方法用无菌吸管吸取原水样l ml或取2-3个适宜浓度稀释液l ml，注入灭菌平皿中。倾注约15ml已溶化并冷却到45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即旋转平皿，使水样与培养基充分混匀，每个稀释度平行三皿。另设三皿空白对照（？）。,微量移液器的使用方法,吸液时到第一格； 吸液时轻放； 排液时到第二格；
5、排液时快推。,（3）培养,待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37恒温箱内培养24小时，进行菌落计数，即为l ml水中的细菌总数。,（4）菌落计数,先计算同一稀释度的平均菌落数，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不予采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。,微生物菌落及计数方法,各种不同情况的计算方法：, 首先选择平均菌落数在30-300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-3
6、-1例次1)。 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较少的菌落总数(见表4-3-1例次2及3) 。, 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-3-1例次4)。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-3-1例次5)。 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间则以最近300或30的平均菌落乘以稀释倍数报告(见表4-3-1例次6)。,四、实验结果,你所测得的1ml待测水样中的细菌数（附详细的计算过程，列表说明）。,五、思考题,用这种方法是否测得全部水中细菌？为什么？,
