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1、学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复
2、制手段保存和汇编本学位论文。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日湖北工业大学硕士学位论文第 1 章引言1.1选题背景人类社会的生存和发展，是离不开优质能源的出现和先进的能源技术的应用。每一次能源时代的变迁，都伴随着生产力的巨大飞跃。如何认识能源发展趋势，选择什么样的能源发展战略，采用什么样的政治措施，是一个十分重要的问题1。面对日益严重的能源和环境问题，加强可再生能源的开发和利用时我国经济发展的必由之路。而从目前世界能源的消费趋势，我们能够很明显的发现，世界能源利用过程已然进入了一个新的纪元，能源消费结构的多元化和多极化开辟了未来人类社会能源发展的新方向2。随石油、煤炭、天
3、然气等化石能源的日益枯竭，生物沼气能源作为人类历史上最古老的能源之一再次引起人们的关注。沼气作为绿色能源，完全燃烧后只产生水和 CO2，而产生的 CO2原本便来源于绿色植物光合作用固定的本来就存在于环境中的 CO2，可以说是 CO2的零排放。而且 1 立方米沼气完全燃烧后，能产生相当于0.7 千克无烟煤所提供的热量。因此，与石油、煤炭、天然气等矿质能源比较，生物沼气是一种更为洁净且可再生，可以很好的解决能源危机问题的能量资源3。凡是有生物的地方都有可能获得制取沼气的原料，所以沼气是一种取之不尽，用之不竭的可再生能源。而我国地广人多，生物资源非常丰富，潜力很大，而且沼气在我国农村分布广泛，所以在
4、我国，用沼气作为一种主要能源物质是非常有可行性的。研究表明，21 世纪无论在农村还是在城镇，都可以根据本地实际情况4可再生能源法等相关法律条例的颁布及越远越多人对可再生资源的关注，有了更好的发展平台和空间5。1.2 甲烷菌概述人类对甲烷菌的认识有大约 150 年的历史，而对甲烷菌的研究始于 1899 年，直到 51 年后的 1950 年 Hungate第一次创造了无氧分离技术才使甲烷菌的研究得到了迅速的发展6。到目前为止，从系统发育来看，甲烷菌分为 5个目，分别为甲烷杆菌目 (Methanobacteriales)、甲烷球菌目 (Methanoco-ccales)、甲烷八叠球菌目(Methan
5、osarcinales)、甲烷微菌目 (Methanomicrobiales)、甲烷超高温菌目1就地利用生物资源产生沼气作为能源 。而我国生物质能源的开发和利用随着国内湖北工业大学硕士学位论文(Methanopyrales)7。甲烷菌分布自然界中各种极端厌氧环境中，不论是在稻田，沼泽地、河湖淤泥、海洋沉积物中，人和动物的肠道，瘤胃动物的胃液中，还是在废水处理、堆肥和污泥消化等自然或者非自然的生态系统中都有其存在着8。只要是甲烷菌就一定是专性严格厌氧菌，对氧极度敏感，一旦遇氧会立即受到抑制，不但不能生长繁殖，更严重的甚至还会死亡9。甲烷菌能正常生长的氧化还原电位在-320mv以下。而拥有这样低的
6、氧化还原电位的环境实际上是绝对无氧的。据试验证明，甲烷菌可以在氧化还原电位-150mv下生长，但生长十分缓慢10。甲烷菌生长极度缓慢，在人工培养条件下，要经过十几天甚至几十天才能长出菌落，而在自然条件下则更长。其原因在于可利用的底物很少，只能利用很简单的物质，如二氧化碳、氢、甲酸、乙酸等，而这些简单的物质必须依靠其他水解菌和产酸菌把复杂有机物分解后提供给甲烷菌，因此甲烷菌要等到其它细菌都大量生长以后才能生长，所以它的世代时间相对较长11。甲烷菌体中有七种辅酶因子与所有微生物及动植物都不同。而上述这七种辅酶或因子分别是：辅酶 M(CoM)，辅酶 F420，F430，F342，B因子，CDR因子和
7、运动甲烷杆菌因子。这些在甲烷菌中发现的辅酶或因子，经过无数次的检查和分析，都是在其它生物和真核生物中均不存在的物质。例如辅酶 F420在形成甲烷过程中起着重要作用，是一种低分子量荧光化合物，在 420nm波长的紫外光照射下，能产生自发的蓝绿色荧光，这一现象被普遍使用来鉴定甲烷菌的存在。1.3 甲烷菌代谢的研究甲烷菌是一种古老的细菌，一直以来都为人类所关注和利用。近年来随着厌氧技术的飞速发展，亨盖特技术、厌氧培养箱技术等日趋成熟，人们从原始的关注甲烷菌的性状和应用开始将视觉更多的关注在甲烷菌的代谢机制12，并且形成了比较全面的认知。甲烷菌生活在厌氧环境中，它们通过甲烷的生物合成产生维持细胞本身生
8、存所需的能量。甲烷菌的主要代谢途径主要包括：原核细胞和真核细胞所共有的糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)、氨基酸和核苷酸代谢12。但一些原核生物及真核生物代谢途径中基本所需的酶在甲烷菌中未被确定，如在 Methanopyruskandleri AV19的 TCA循环中缺乏将两分子丙酮酸缩合成一分子六碳三羧酸所需的酶。在 M.kandleri,M.thermoa和 M.jannaschii中均不存在由丙酮酸货磷酸烯醇式丙酮酸形成苹果酸所需的酶12。2湖北工业大学硕士学位论文甲烷菌是自养型的生物，在甲烷菌中发现了许多无机物进入细胞所需的通道蛋白；同时还能运输亚砷酸、磷酸、硫酸、硝酸等无机酸
9、。甲烷菌还具备运输乳酸、六碳三羧酸、六碳二羧酸等有机物进入细胞的转运蛋白12，它能极大程度的利用环境中的化学能。图1-1.甲烷生物合成的3种途径Figure1-1.Methane biosynthesis of three kinds of ways甲烷的生物合成途径如图 1-1所示，目前发现的甲烷合成过程主要有三种途径。第一种途径为以乙酸为原料的甲烷生物合成,占自然界甲烷合成的 60%以上；第二种为以氢、二氧化碳为原料的甲烷生物合成占 30%左右；第三种是以甲基化合物为原料的生物合成过程，如甲醇、甲基胺等。三种途径都是原料经由甲基辅酶 M，甲基辅酶 M还原酶和甲基辅酶 M还原酶的催化下最终形
10、成甲烷12。在此过程中有多种辅酶参与反应，如：甲酰甲基呋喃(MFR)、甲酰四氢甲基喋呤(THMP)、辅酶 M (HSCoM )、辅酶 F420(CoF420)、辅酶 F430(CoF430)和辅因子 B(HHTP)。3湖北工业大学硕士学位论文图1-2. A 辅酶M 到甲基辅酶M 的转变B 甲基化合物到甲基辅酶M 的转变Figure1-2. A Changes of Coenzyme M to methyl-coenzyme MB Changes of Methyl compounds to in methyl-coenzyme M如前所述，甲烷形成的过程伴随着细胞膜内外化学梯度的形成，这种梯度
11、的形成过程类似于以氧为末端电子受体的氧化磷酸化和电子传递链的偶联12。在化学梯度形成过程中，Na+离子梯度的形成是由钠离子泵-methy1THMP：HSCoM甲基转移酶实现的，H梯度的形成是由位于细胞膜上的 I-IDR实现的，I-IDR催化与 HTPSS-CoM的还原偶联的氢的氧化。形成的 Na和 H梯度最终驱动位于细胞膜上的 ATP合成酶产生。图 1-1中由乙酸生成甲烷的代谢途径中乙酸首先磷酸化生成乙酰磷酸，乙酰磷酸再转化为乙酰辅酶 A，乙酰辅酶 A在乙酰辅酶 A脱羧酶(ACDS)的催化下形成 1分子甲基四氢甲基喋呤(methy1-H4SPt)和 1分子一氧化碳，一氧化碳在一氧化碳脱氢酶(C
12、ODH)的催化下脱氢形成 CO2，同时形成还原型的铁氧化蛋白。还原型的铁氧化蛋白通过细胞膜的细胞色素蛋白将氢质子泵出细胞膜形成质膜内外的质子梯度差，甲基四氢甲基喋呤在 methy1-THMP：HS-CoM甲基转移酶的作用下将甲基转移给 HS-CoM，形成甲基辅酶 M，同时将 Na泵出细胞膜。以二氧化碳和氢为原料的合成途径通过一系列的电子传递过程形成甲基辅酶 M，后续的步骤和乙酸途径相同。以甲基化合物为底物的甲烷合成过程都要通过图 1-2B所示的过程将甲基转移给 HS-CoM，此过程需要 2种酶甲基转移酶 1(MT1)和甲基转移酶 2(M)，不同的底物需要不同的 MT1和 MT2，已知的 MT1
13、、类钴啉蛋白(eorrinoid protein)和 MT2各有十多种12。尽管现阶段我们对甲烷菌代谢机理有一个相对全面的认识，但是厌氧发酵产沼气过程始终是一个错综复杂的过程，沼气厌氧发酵微生物菌群的代谢机理还有4湖北工业大学硕士学位论文待更进一步的研究和发现。1.4 沼气发酵的国内外研究和发展现状在当今社会由于石油、天然气价格上涨、环境污染严重以及全球气候变暖等因素影响，能源问题日趋严重，利用“生物沼气”改善能源的使用受到社会大众越来越普遍的注意。所谓“生物沼气”，主要是利用城市生活垃圾、农作物废料甚至污泥等分解产生主要成分为甲烷和二氧化碳的气体，用于发电和供热。甲烷含量越高，则气体品质越好
14、。作为能源，“生物沼气”有能够作为一种很好的清洁燃料供生活所用，同时还能作为一种动力能源。中国是世界上最早关注和利用沼气的国家之一。改革开放以来，政府大力支持我国沼气事业的发展，尤其是农村的沼气事业得到了充分发展13。我国的沼气建设走在了世界前列，但目前主要的建设都是户用小型沼气工程，大型沼气工程规模普遍偏小。这是由于中国土地所有权分散，沼气产业虽然起步较早、数量多，但大多都是小型户用沼气工程，所以沼气总产量少，目的也不过是是方便做饭和照明，并没有将其作为大量使用的能源对待。近几年由于禽畜场的规模化发展，禽畜粪水以及工业有机废弃物利用厌氧发酵工艺开展治理，大规模的沼气工程才逐渐发展壮大。但真的要实现工业化大型沼气工程，我还是得向包括德国在内的欧
