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1、EphA2在大肠腺癌中的表达,第一部分,大肠腺癌中EphA2表达及其与临床病理学因素、DNA倍体、细胞周期关系的研究,EphA2基因的介绍,EphA2是Lindberg于1990年用简并引物从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的一个Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亚家族成员 。 人EphA2基因定位于1p36.1,有17个外显子。 Eph受体家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受体激酶和他们EFN配体介导的细胞信号传 导参与神经系统的基本发生
2、过程、神经系统的信号传 递，在细胞的分化、发育、增殖，组织和器官的形成、血管生成、细胞与细胞之间的粘附及肿瘤的发生和肿瘤的新生血管的形成等过程中发挥重要的和必不可少的作用。,EphA2与肿瘤的关系,EphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系，如：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，肾细胞癌等，目前认为EphA2参与肿瘤的发生和发展，是功能强大的癌基因。 EphA2的高表达能诱导非转化乳腺和前列腺上皮细胞在体内、外的恶性转化，并促进其侵袭转移 。 应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验，下调EphA2蛋白表达的同时，也抑制了肿瘤细胞的生长，进而降低肿瘤的恶性程度 。,154例大肠腺癌组织和相
3、应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河南省肿瘤医院2001年1月2004年12月手术切除标本的存档蜡块 (其中66例为手术切除新鲜标本和蜡块和88例存档蜡块),1份置4%多聚甲醛中固定存放,另2份置-82中存放,石蜡包埋、切片、 HE 染色,石蜡包埋、切片，进行免疫组化,提取总 mRNA、 进行RT- PCR,实 验 标 本,FCM检 侧DNA 倍体、细 胞周期 细胞增 殖率,临床病理资料,154例（88例存档石蜡包埋标本和66例手术切除新鲜大肠腺癌标本）大肠腺癌患者，术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。其中男性 78例，女性 76例，年龄在 23-85岁之间，平均年龄为 49.7
4、岁。,66例新鲜手术切除标本均为大肠腺癌： 分化程度:高分化腺癌30例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌13例。 浸润深度:粘膜层10例，粘膜下层0例，肌层14例，浆膜层37例，外周组织5例。 转移：有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者50例；有血道转移者1例，无血道转移者65例；无种植性转移。,88例存档蜡块全部为腺癌: 分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例； 浸润深度：粘膜层62例，粘膜下层1例，肌层17例、浆膜层5例，外周组织3例； 转移：有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者74例；有血道转移者11例，无血道转移者77例；有种植性转移者10例，无种植性转
5、移者78例 。,技 术 路 线,免疫组化（SP法),FCM,RT-PCR技术,检测154例大肠腺癌组织和相应正常食管组织中EphA2蛋白表达,检测66例大肠腺癌手术切除新鲜组织和相应正常大肠粘膜手术切除新鲜组织中DNA倍体、细胞周期、细胞增殖率,探讨EphA2表达与大肠腺癌病理临床因素、DNA倍体、细胞周期的关系,检测66例大肠腺癌手术切除新鲜组织和相应正常大肠粘膜手术切除新鲜组织中EphA2mRNA表达,一. 免疫组化 步骤 （略） 对照组设计：以已知EphA2阳性食管鳞癌和正常食管粘膜腺体组织切片作为阳性对照，用正常兔IgG代替一抗作为阴性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。 免疫组化结果
6、判定及定量分析：EPhA2免疫组化阳性表达位于细胞胞浆，呈棕黄色。定量分析采用高清晰图像处理系统，随机取10个高倍视野进行图像分析，对免疫组化切片检测EphA2阳性细胞数，依据阳性细胞所占肿瘤细胞面积的百分比和染色强度判断结果。,实 验 方 法,二 .组织中总RNA的提取及RT-PCR 步骤 （略） RNA浓度的测定 （略） 对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。 （2）内参对照：用-actin作为内参引物，与EphA2和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下出现一条330bp的荧光带 结果判定 阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝胶电泳后在紫
7、外灯下分别出现一条586bp的荧光带。,实 验 方 法,取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g,剪碎100、300目尼龙网上搓,收集细胞液，800prm/min离心2min,70%乙醇(4)中固定1h,LPR染液,避光冷藏(4)5min,Stain 1ml避光30min.,上机检测,FCM实验步骤：,FCM对照组设计和诊断标准：,设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量 和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 DNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10000个细胞,具有相同DNA含 量的细胞群表现为直方图中独立的峰,即每个峰表示一定DNA含量或倍体 的细胞亚群。
8、在正常对照组中,第1个峰代表单倍体(2C)细胞亚群,在实验 组中，第1个峰代表双倍体(G0/G1 ,2C)细胞亚群,第3个峰则代表四倍体 (G2/M，4C)细胞亚群，两峰之间代表S期细胞亚群。计算机系统算出每 个峰下的面积所表示的该倍体的细胞占全部细胞的百分比。 诊断标准:根据左连富的标准,DNA倍体单倍体细胞百分数与正常对照组 单倍体细胞平均百分数相比较,在其两个标准差之内为正常,否则为异常。,FCM计算标准：,DNA指数(DI)计算公式：DI=样品细胞G1峰道数均值正常组织细胞G1峰道数均值。 DNA含量分析:以DNA指数(DI)表示细胞DNA相对含量，根据DI值判断DNA倍体。0.9DI
9、 1. 1 为DNA二倍体;DI 1. 1 为异倍体。 细胞周期分布的计算：运用DNA细胞分析软件，计算出各时相的分布百分比，以S期细胞比率(SPF)和增殖指数（PI）表示细胞的增殖活性。 SPF( %) = S ( G0/ G1 + S + G2M) 100 % PI=(S+G2)（G1+S+G2）100%,统计学处理,所有数据均经SPSS 12.0软件进行统计分析。计数资料计算阳性率，计量资料用采用XS表示；阳性率之间的比较采用2检验（chi-square）及Fisher确定概率计算法；两组均数的比较用t检验(t-test)；两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）和 Spearman等
10、级相关分析；两变量之间的关系分析采用相关分析；多变量之间的关系分析采用秩和Chi-sguare 检验；行程列表Chi-sguare检验。显著性水准=0.05。,结 果,EphA2mRNA及蛋白表达与大肠腺癌的关系：免疫组化结果,免疫组化检测结果： EphA2蛋白定位于癌细胞、粘膜上皮细胞及癌组织血管内皮胞浆内，呈棕黄色。 阴性对照均无阳性显示。,大肠腺癌组织及正常粘膜组织中EphA2蛋白的表达,正常粘膜 116(75.3) 6(3.9) 26（16.9） 6（3.9） 1.3690.663 腺 癌 12（7.8）32（20.8）48（22.7） 62（40.3）4.7890.542,组别 Ep
11、hA2蛋白表达（例数%）a 阳性细胞面积（XS)b 0级 I级 II级 III级,一. 大肠腺癌组织和正常粘膜组织中EphA2蛋白表达,注：a:2=70.5706, P0.0001;b:2=90.523, P0.0001,正常粘膜组织中EphA2蛋白表达 SP法 200,大肠腺癌组织中 EphA2蛋白表达 SP法 200,二.EphA2蛋白表达在大肠腺癌癌细胞与癌组织中血管内皮细胞的比较,EphA2蛋白表达例数(%) 组别 0级 I级 II级 III级 肿瘤细胞 200(11.2) 930(45.6) 700（35.0） 170（8.2） 血管内皮细胞 170（8.3） 940（46.1） 6
12、90（34.5） 200（11.2）,注:2=1562.1481，2 =90.272， P0.000,大肠腺癌组织中癌细胞和血管内皮细胞EphA2蛋白的表达 SP法 400,三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （A),临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P 年龄a 30 7 0 (00.0) 2 (1.30) 2 (1.30) 3 (1.95) 5170 79 4 (5.1) 16 (20.3) 26 (32.9) 33(41.8) 70 30 5 (16.7) 8 (26.8) 9(30.0) 8(26.8) 0.577
13、性别b 男 78 7(9.0) 21 (26.8) 26(33.3) 2 4(30.9) 女 76 5 (6.6) 11(14.5) 22 (28.9) 38 (50.0) 0.074 a: 2=7.580; b:2=6.928,临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P,肿 瘤部 位c 升结肠 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 横结肠 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降结肠 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙状结肠 23 3(13.0)
14、3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 肠 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 结肠 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798 大体类型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 溃疡型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸润型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228,c:2=9.8600; d：2=7.5625,三、EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系 （B),详细部位不清,EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系(C),临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P,肿瘤体积 (直径cm) 9.1 7 2(28.6) 2(28.6) 2(28.6) 1(14.2) 0.533,2=10.723,EphA2蛋白表达与大肠腺癌患者临床病理学因素的关系(D),临床病理 EphA2蛋白表达例数(%) 学因素 例数 0级 I级 II级 III级 P,分化程度a
