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1、 陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册陶瓷羟基磷灰石层析应用及放大手册 （仅用于仅用于仅用于仅用于参考参考参考参考与与与与交流交流交流交流） 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 2 / 70 目录目录目录目录 第一章 简介. 4 第二章 产品介绍. 7 2.1 陶瓷羟基磷灰石 . 7 2.2 纯度 . 9 第三章 羟基磷灰石层析. 10 3.1 CHT 羟基磷灰石机制 . 10 3.2 CHT 在纯化过程中化学变化 . 11 3.2.1 CH
2、T 化学反应 . 11 3.2.2 缓冲液中阳离子浓度对于 CHT 表面化学性质的影响 . 12 3.3 方法指导 . 13 3.3.1 化学兼容性 . 13 3.3.2 洗脱 . 14 3.3.3 Co-Buffers 使用 . 15 3.3.4 SNS . 16 3.3.5 钙离子 . 17 3.3.6 磷酸根 . 17 3.3.7 微量金属元素污染 . 18 3.3.8 磷酸盐制备 . 18 3.3.9 其他清洗 . 19 3.3.10 工艺开发 IA:lgG . 20 3.3.11 工艺开发 IB：lgG . 20 3.3.12 工艺开发：磷酸盐洗脱 . 21 3.3.13 工艺开发：
3、质粒 . 21 3.3.14 工艺开发：酸性蛋白 . 22 3.3.15 条件摸索 . 22 3.3.16 工艺优化 . 23 第四章 再生，灭菌和贮藏. 24 4.1 再生 . 24 4.2 灭菌 . 24 4.3 贮藏 . 24 第五章 装柱. 25 5.1 一般原则 . 26 5.2.1 推荐的装柱缓冲液 . 28 5.2.2 搅拌 . 28 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 3 / 70 5.2.3 填料传送 . 29 5.3 开放式柱子装柱 . 31 5.4 密闭层析柱装填 . 33 5.
4、4.1 介质转送工作站 . 33 5.4.2 吸入式填料传送 . 35 5.4.3 卸柱 . 36 5.5 装柱工作站 . 37 5.6 柱效测试 . 39 5.7 装柱 . 42 5.7.1 对于可以调节柱头的柱子 . 42 5.7.2 对于靠压力的密闭柱子 . 43 5.7.4 调节柱子进行工艺开发 . 43 5.8 实验室规模装柱 . 44 5.8.1 Millipore Vantage L 柱子 . 44 5.8.2 Econo 柱装柱 . 47 第六章 实例分析. 49 6.1 装柱GE Chromaflow 900/200-400 . 49 6.2 装柱-Prototype Mil
5、lipore IsoPak IP P350/500 . 51 附录. 54 A1 CHT 与 缓冲液表 . 54 A2 EDTA 络合滴定测定 CHT 流出液中钙离子浓度 . 60 A3 参考文献 . 65 A4 其他资料 . 65 A5 订货信息 . 65 A6 常见问题 . 66 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 4 / 70 第一章第一章第一章第一章 简介简介简介简介 羟基磷灰石由钙和磷酸盐形成的化合物。晶体状羟基磷灰石已经被广泛应用于生物活性分子的分析、制备及工业化生产。但是，由于晶体结构的
6、易碎的原因，限制了生产的流速和柱子的高度。20 世纪 80 年代，科学家掌握了高温下烧灼晶体让它形成更加坚固，大孔球状， 这允许使用者在非常高流速和压力下不破碎。 这就是今天被广泛应用在生物分子纯化的陶瓷羟基磷灰石， 该说明书将指导你如何更好的应用陶瓷羟基磷灰石纯化各种生物分子。 第二章将详细的介绍陶瓷羟基磷灰石的特性。 陶瓷羟基磷灰石 （CHT） 目前有两种型号： 型和型。两种型号主要由不同烧灼温度及时间生成。CHT 是一个混合作用的介质。第三章将详细介绍该介质作用机制。 CHT 在今天更加重视生物下游技术的生物制药企业已经发展成为纯化首选的介质。它混合纯化机制可以提供独特的选择性，能够分离
7、其他介质不能分离的各种比较难分离的、性质比较接近的生物分子。CHT 可以用于宿主蛋白(HCP)、脱落的 protein A、抗体二聚体及聚合体、核酸及病毒的分离，可以用于捕获、中度纯化或精纯各个纯化阶段。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 5 / 70 表 1.1 杂质去除 Contaminants Reduction，logs Aggregates 1-2 Protein A 1-2 Host cell proteins 2 DNA 3 Endotoxin 4 X-MuLV(log10) 4 MV
8、M(log10) 2 CHT 可以提高纯化效率，收率和节约成本： ? 在各种规模下和高流速下良好的捕获能力 ? 各种来源样品保持高的载量 ? 独特的选择性可以让你减少纯化步骤 该指导可以让你在纯化过程中更好地使用 CHT， 主要包括五个部分： ? 产品描述 ? 纯化 ? 再生，灭菌及贮藏 ? 装柱 ? 纯化应用 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 6 / 70 该指南是在整理来自全球的层析研究人员的反馈基础上，为你提供从层析方法摸索、优化、装柱等方面全面的指导。如果你有更多的问题，请随时联系当地的销售
9、代表或技术支持。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 7 / 70 第二章第二章第二章第二章 产品介绍产品介绍产品介绍产品介绍 2.1 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石 羟基磷灰石，分子式：Ca10（PO4）6(OH)2，是一种磷酸钙化合物，包括钙离子(C 位点)，羟基，磷酸根（P-位点） 。CHT 具有独特的分离效果，良好的选择性和分辨率。经常用于分离其他介质所不能分离的、性质比较接近的蛋白。 CHT 主要应用包括： ? 不同亚型抗体及多克隆抗体 ? 抗体轻链 ? 抗体片段
10、? 重组蛋白 ? 病毒颗粒 ? 疫苗 ? 酶 ? 超螺旋 DNA ? 单链 DAN 与双链 DNA CHT 是球形、大孔羟基磷灰石，经过高温烧灼和修饰，从纳米晶体形成了陶瓷结构。陶瓷结构保持了纳米晶体结构独特的分离特性， 同时批与批之间一致性保证了大规模层析的重复性和稳定性。 不像其它介质，CHT 既是机制有时功能基团。如果你以前使用晶体状磷灰石开发的工艺，层析的条件仍然可以适用于陶瓷羟基磷陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 8 / 70 灰石，某些情况可能需要做个小的优化。 CHT 型和型 都提供三
11、种颗粒规格：20um，40um，80um。两种类型的 CHT 的洗脱特性与晶体状磷灰石基本一致，但是仍然有些差异。 CHT 的蛋白载量比较高，且对酸性蛋白具有更高的载量。 CHT型 载量较型载量低，对核酸及某些蛋白具有更好的分辨率。同时 CHT型对白蛋白有低的亲和力，更适合纯化各类免疫球蛋白及其亚型。 表 2.1 技术参数 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 9 / 70 2.2 纯度纯度纯度纯度 在陶瓷羟基磷灰石制造过程中，我们选用高纯度的原材料，并且通过电偶和等离子质谱对金属离子分析，通过离子层析
12、控制阴离子，严格控制各种污染物，保证产品的纯度。 表 3 纯度 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 10 / 70 第三章第三章第三章第三章 羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析 3.1 CHT 羟基磷灰石机制羟基磷灰石机制羟基磷灰石机制羟基磷灰石机制 羟基磷灰石包括两个结合位点：Ca2+ 和 PO43-。这些结合位点按照其自有的晶体结构分布。PO43离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有阳离子交换特性； 其中的 Ca2离子与带负电蛋白质的自由羧基簇以金属螯合方式结合。 阳离子交换
13、作用： 阳离子交换作用：当蛋白带负电荷时候，可以与 PO43-结合，而与Ca2+是相互排斥，这种作用主要是阳离子交换作用。这种阳离子交换作用会受到洗脱缓冲液中的中性盐浓度（如;NaCl）或者平衡液中磷酸盐浓度的影响。这种作用随着 pH 的增高也会相应减弱。因此，增加盐、磷酸盐的浓度或增高 pH，都会减弱目的蛋白与 PO43-之间的相互作用。 钙金属螯合作用：Ca2+ 可以与蛋白或其他分子（如;核酸）表面的羧基簇或磷酸基团发生金属螯合作用，而同时与 PO43-相排斥。这种结合方式作用力是一般离子交换的 15-60 倍。 所以这种结合方式受离子的影响比较小，对 NaCl 不敏感。而且这种作用力随着
14、离子强度会增加钙金属螯合力， 原因是由于离子强度的增加屏蔽了分子表面功能基团与 PO3-之间的相互排斥作用。这种结合方式可以通过磷酸钠进行洗脱。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 11 / 70 Fig 3.1 CHT 作用机理 3.2 CHT 在纯化过程中化学变化在纯化过程中化学变化在纯化过程中化学变化在纯化过程中化学变化 3.2.1 CHT 化学反应化学反应化学反应化学反应 Ca10(PO4)6(OH)2 10Ca2+ + 6PO43- +2OH- 通常情况，羟基磷灰石的 Ksp 值为 10-5
15、8.尽管平衡常数非常低，但是在水溶性环境中仍然不能忽视。在溶液中钙离子与磷酸根形成了 pH依赖性的平衡。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 12 / 70 从化学反应方程式提示 CHT 的使用： 1 保持 pH 高于 6.5：保持羟基（OH）浓度尽可能高，这样可以保持CHT 维持在不可溶和原始状态。 2 在各个层析溶液中添加钙和磷酸浓度，可以使得 CHT 更加稳定。 更多的维持 CHT 稳定性策略将在后面详细讨论。 3.2.2 缓冲液中阳离子浓度对于缓冲液中阳离子浓度对于缓冲液中阳离子浓度对于缓冲液
16、中阳离子浓度对于 CHT 表面化学性质的影响表面化学性质的影响表面化学性质的影响表面化学性质的影响 CHT 的表面结构见图 3.2. 不同溶液的 pH 会使得暴露在溶液中磷酸基团不同程度的质子化。特别磷酸酰氧原子质子化。如果溶液中阳离子（图示以 Na 离子为例）浓度增多，钠离子替代一些质子，质子进入了溶液，引起了 pH 下降,见图 3.3.这种 pH 下降的现象是可逆的：当溶液中的阳离子浓度降低就会引起质子再吸附到 CHT 上，导致溶液 pH 增高。这种质子的吸附和解吸附的过程已经得到深入的研究 （Bankston et al 2010,Pabst et al,2008）.在纯化过程中，监控柱
17、子洗脱过程中的 pH 变化是非常重要的，并且解决任何可能导致 pH 下降到 6.5 一下的任何因素。长期暴露在 pH6.5 酸性条件下降造成 CHT 的损坏。 PH 的下降将减少 CHT 的使用次数。下面我们，我们将介绍几种重要的减轻或消除 pH 下降的方法。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 13 / 70 3.3 方法指导方法指导方法指导方法指导 过程的优化要考虑多种因素： 基质相互作用， 洗脱条件， 放大， 法规，药物安全，工艺稳定性及经济性等。下面四个纯化方案(Fig3.4)可以作为大多数蛋
18、白和核酸纯化起始条件，减少你研发时间。我们将在3.310-3.3.14 详细介绍每个方案的关键点。 3.3.1 化学兼容性化学兼容性化学兼容性化学兼容性 所有缓冲液中不能含柠檬酸或 EDTA， 这些螯合剂会降解 CHT。 CHT 在陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 14 / 70 含有钙和磷酸根存在，pH6.5-14 溶液中,可以兼容以下试剂: ? 2M NaOH* ? 6 M Guanidine-HCl ? 8M Urea ? 100% acetonitrile ? 100% ethanol/me
19、thanol ? 1%SDS or other surfactants (not calcium compatible) ? 4 M NaCl ? 1 M potassium phosphate* ? 0.5M sodium phosphate* *No Ca or PO4 required * No Ca required 3.3.2 洗脱洗脱洗脱洗脱 在洗脱过程中，缓冲液溶液盐浓度，缓冲液种类或其他元素的变化都可能导致流动相中 pH 的短暂变化。这种现象主要是流动相中的离子与 CHT 表面的磷酸基团相互作用的结果。pH 的漂移程度主要取决于离子的交换的程度。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶
20、瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 15 / 70 3.3.3 Co-Buffers 使用使用使用使用 Co-buffer，如 MES,MOPS 或 Histidine，加入到洗脱液中可以大幅度减低 CHT 中质子释放。见 Figure 3.5. Fig 3.5 Effect of MES addition on effluent pH during a step elution of CHT with 0.1M(A) or 1.0M NaCl(B) The column had previously been equilibra
21、ted with 10mM phosphate, pH 6.8 ,no MES; ,+15mM MES; ,+100mM MES; 尽管添加 Co-buffer 之后，pH 下降的幅度大大减少了，减少了 CHT暴漏在低pH环境的时间。 这将会大大提高CHT的使用次数。 Co-buffer使用量随着洗脱的条件而变化。 Table3.1 给出了一些起始Co-buffer 浓度建议。 备注：对许多 Co-buffer，首先以酸形式被添加，溶液用 NaOH 滴定陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 16 / 7
22、0 到最终 pH。 如果在 Co-buffer 研究之前洗脱盐浓度已经确定，那么就需要减少洗脱溶液中 NacCl 的量， 因为 Co-buffer 中和过程中会产生一些盐。 3.3.4 SNS 理想状态下， 如果所有 CHT 表面的质子在洗脱前能够被中性的阳离子替换而不影响珠子的性能， 这样在洗脱过程中阳离子浓度的增加就不会对 pH 影响。Bio-rad 根据这个原理发明了一种称为表面中和溶液（SNS） 。 简而言之， 就是在洗脱之前增加一个弱碱洗脱步骤。 见Figure 3.6. 典型的过程是用 25mM Tris， 25Mm NaCl, 5Mm phosphate, pH7.75 清洗 6
23、-8CV。 Tris 在整个过程中维持整个溶液微碱性，提供大量的氢氧根，与释放的质子迅速结合水。 这种溶液已经在 20*20cm 的柱子上证明能够大幅 提 高 柱 子 的 寿 命 。 许 多 别 的 溶 液 ， 如 Arginie,lysine ，histidine,PIPES,HEPES,ACES MOPS,MOPSO,在3.2cm 直径柱子也显示有效的提高柱子寿命。 单抗研究显示， 与传统方法比较， 使用 SNS 后，产品质量（产量，洗脱峰位置，聚合体含量，DNA,HCP）都一样。除此之外， 就测试抗体发现， 对于使用 SNS 40 次后载量没有发生改变。陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟
24、基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 17 / 70 在一些研究中，酸性蛋白会在 SNS 步骤中被洗脱下来。可以对洗脱液质量做个鉴定确定是否可以直接使用 SNS 作为洗脱缓冲液。 3.3.5 钙离子钙离子钙离子钙离子 在 3.2.1 提到，钙离子也可以增加 CHT 柱子寿命。通过测量平衡液，上样和洗脱液中的钙离子浓度来决定添加钙离子的数量。 这种测定可以通过非蛋白样品在小柱子运行多次获得有效的数值。 测试每个样品大概需要 10min， 直接通过标准的比色法分析获得， 详细见附录 A2.96孔板也可以利用，具体可以联系 Bio-rad.因
25、为钙和磷酸在溶液状态会发生沉淀，确保钙的浓度在缓冲液中低于可溶性限度。钙离子有很好稳定能力，可以添加到任何钙离子泄露的溶液中。对于再生和清洗溶液中可以不需要添加钙离子。 3.3.6 磷酸根磷酸根磷酸根磷酸根 在 3.2.1 提到，磷酸根可以提高 CHT 的坚固性。通常，所有缓冲液都应该包含 5mM 磷酸盐。当缓冲液 pH 大于 7.0，磷酸盐浓度可以降低到 2mM.高于 5mM 磷酸盐浓度可能会降低蛋白的结合。 见 Figure 3.7, 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 18 / 70 50Mm
26、MES 缓冲溶液中随着磷酸盐浓度增加 CHT 的载量随之减低。 3.3.7 微量金属元素污染微量金属元素污染微量金属元素污染微量金属元素污染 CHT 可以与溶液中微量金属元素结合，如铁离子。金属元素污染可能来源于样品，缓冲液和盐，生产用水，或者腐蚀的不锈钢。随着微量金属元素的沉积， 柱子上部就形成了一有色层。 如果出现了这个问题，可以再过滤之前用 CHT 预处理缓冲液， 或者在上样前安装一根 CHT 保护柱。 也可以添加微量的钙饱和 EDTA,具体更多细节请联系 Bio-Rad. 3.3.8 磷酸盐制备磷酸盐制备磷酸盐制备磷酸盐制备 在所有缓冲液中制备都需要用含水磷酸盐。不能使用无水磷酸盐，因
27、为这些盐的制造过程会导致焦磷酸盐产生。 焦磷酸盐会抑制一些大分子的结合和减少 CHT 的选择性。配置过程中避免 pH 反滴定，因为这会增加电导和减少目的蛋白结合。避免使用十二水化合物，因为十二水化合物会自然会降解为七水化合物。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 19 / 70 如果钙使用过量，就会与 CHT 的磷酸根位点结合，同时会与再生的磷酸盐缓冲液形成沉淀。 3.3.9 其他清洗其他清洗其他清洗其他清洗 如果洗脱液中钙离子水平高于 10ppm，在高磷酸盐洗脱之前用 pH 7.5-8.0 的低磷酸
28、盐缓冲液清洗 3 个柱体积。同时，在涉及高磷酸和高 NaOH 溶液之间步骤增加 0.5CV 清洗步骤。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 20 / 70 3.3.10 工艺开发工艺开发工艺开发工艺开发 IA:lgG 3.3.11 工艺开发工艺开发工艺开发工艺开发 IB：lgG 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 21 / 70 3.3.12 工艺开发工艺开发工艺开发工艺开发：磷酸盐洗脱磷酸盐洗脱磷酸盐洗脱磷
29、酸盐洗脱 3.3.13 工艺开发工艺开发工艺开发工艺开发：质粒质粒质粒质粒 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 22 / 70 3.3.14 工艺开发工艺开发工艺开发工艺开发：酸性蛋白酸性蛋白酸性蛋白酸性蛋白 3.3.15 条件摸索条件摸索条件摸索条件摸索 目的蛋白通常用磷酸盐梯度洗脱。 根据最初的洗脱结果调解线性洗脱的梯度。洗脱也可以用阶段洗脱或流穿模式。通常，蛋白的保留时间随着 PI 的增高而增强。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手
30、册应用及放大手册应用及放大手册 23 / 70 3.3.16 工艺工艺工艺工艺优化优化优化优化 1 选择最佳的缓冲液试剂， 确保添加一定量的钙和磷酸盐维持 CHT 基质稳定； 2 样品的离子强度应该与起始平衡缓冲液一致。 稀释，超滤或者用Bio-Gel P-6DG 脱盐等方法都可以使用。 3 对于层析缓冲液，在使用前用 0.2-0.45um 过滤。 4 如果 500mM 磷酸钠不能洗脱目的蛋白（极少） ，可以尝试高浓度的磷酸钾。 5 如果洗脱峰不够尖，尝试使用 10CV 线性洗脱。 6 可以把线性洗脱转化为阶段洗脱。 7 用 5mM 磷酸盐浓度下得到的最大载量决定最佳 pH 陶瓷羟基磷灰石陶瓷
31、羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 24 / 70 第四章第四章第四章第四章 再生再生再生再生，灭菌和贮藏灭菌和贮藏灭菌和贮藏灭菌和贮藏 4.1 再生再生再生再生 需要用 500mM 中性磷酸盐或磷酸钾溶液或 400mM 磷酸三钠 （pH 11-12）清洗 3-5CV 完成再生。 柱子也可以用包含 5mM 磷酸根中性1-2KCl,NaCl, 6M 尿素或 8M 盐酸胍清洗柱子。 4.2 灭菌灭菌灭菌灭菌 柱子可以用浓度至 2N NaOH 消毒，也可以贮藏在 0.1-1N NaOH。 4.3 贮藏贮藏贮藏贮藏 未开启使用
32、的 CHT 可以室温保存。一旦浸润，需要保存在 0.1N NaOH室温保存。 如果使用低于 100mM NaOH，请添加 10Mm 磷酸盐。使用过的 CHT，需要再生和灭菌之后，用不高于 1N NaOH，室温，避免阳光直射保存。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 25 / 70 第五章第五章第五章第五章 装柱装柱装柱装柱 本章主要介绍如何装柱，装柱之前请自己阅读。 好的柱子是指保证填料从上到小均匀和连续， 能够保证层析最好的分离效果。下面章节将涉及装柱缓冲液，柱效测定和柱子放大的条件。 CHT 是坚
33、固，高流速，低反压填料，Figure 5.1 和 Figure 5.2 显示了 40um 和 80um CHT 流速与反压的关系。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 26 / 70 5.1 一般原则一般原则一般原则一般原则 1 CHT 是不可压缩，非球形颗粒，这样仅仅靠填料沉降不可能让填料在柱子里形成完美的立方体的效果。如果有外力的震荡，例如柱子从装住的位置推到生产的位置， 柱子里面的填料将会重新调整。 另外，柱子使用多次之后也会有轻微的调整。这种现象就会造成： ? 由于柱床的压缩就会造成柱高降低（
34、柱头空间增大） ? 由于更好的装柱效果，操作压力增高 2 对于装好的柱子，不要把柱头压进入填料里， 柱头与柱床底部总是留出 0.1-1.0cm 的空隙。 这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力盒玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 27 / 70 度 10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓
35、冲液，用泵以 100cm/hr 线性速度装柱，同时调整马达以 50cm/hr 的线性速度提升柱头，当柱头提升 0.5cm 时候，停止泵和马达。 3 整个层析过程不能反流和反洗。 下面的装柱方法和柱子可以用来装陶瓷羟基磷灰石 CHT: ? 具有马达控制，柱头可以调节高度的轴向开放式柱子 ? 柱头可调节高度，流速装柱的开放式柱子 ? 具有马达控制，柱头可以调节高度的轴向密闭式柱子 ? 密闭的压力装柱的柱子（需要用装柱工作站） 最佳做法： 所有类型的轴向流速大规模层析柱都可以用来装 CHT。装柱前请仔细阅读相关柱子， 接辅助的介质传送装置或层析系统操作手册，确保所有操作都符合该手册的推荐。 5.2
36、填料准备 CHT 最初购买时候以干粉状态保存。当你倾倒干粉时候，请穿戴防尘面罩，手套，安全眼镜和实验室工作服等个人防护装备。5kg CHT 储存罐有塑料密封圈和螺旋盖密闭。密封圈确保储存罐填料装好后没有被打开。 螺旋盖确保密封圈紧密的被密封。 当你发现储存罐上面有灰尘，请用湿布搽干净，然后用干净的干陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 28 / 70 布搽干。使用前，可以翻转几次让 CHT 粉末均匀，自由流动。 5.2.1 推荐的装柱缓冲液推荐的装柱缓冲液推荐的装柱缓冲液推荐的装柱缓冲液 对于装柱缓冲液
37、，至少需要 150mM 离子强度，pH 高度 6.8。下面的装柱缓冲液已经被成功的应用于 40um，80umCHT 装柱： ? 20mM 磷酸盐缓冲液+150Mm NaCl， pH 7.2-8.0 ? 200-400Mm 磷酸钠或磷酸钾， pH 6.8-10 ? 0.15-1 N NaOH 最佳做法： 对于第一次使用，装柱缓冲液不能低于 150mM 离子强度，低于该离子强度可能会形成浑浊的悬浮液。 如果使用高于150Mm 缓冲液，pH 高于 6.8，就会消除或最大减小这种现象。 5.2.2 搅拌搅拌搅拌搅拌 手动搅拌： 不管在溶气罐里或开放式柱子里搅拌， 推荐使用 J 形或可以来回移动的单翼的
38、聚丙烯搅拌桨。标准的圆形搅拌可能会导致均匀混合。 气体搅拌： 如果你的层析朱是用不锈钢筛板， 你可以用气体搅拌。气体搅拌需要用干净的压缩空气，氩气，氦气或氮气，低压搅拌至均匀。气体通过到柱子底部的出口与气体口链接。这种方法可以搅拌至 50%（V/V）浓度的填料悬浮液。当你的柱子是多孔聚乙陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 29 / 70 烯，聚丙烯筛网或者没有支撑的尼龙筛网或不锈钢过滤网时候，请不要需用气体搅拌方面。如果你确定你的柱子类型，请联系柱子制造商。 悬浮液储罐 对于填料储存罐，两种方法推荐。
39、第一方法，使用低剪切力翼型轴流桨，速度控制在镜可以保证颗粒维持悬浮状态而又不引起涡流。第二种方法，气体混合搅拌，气体连接到储液罐的出口。不要用在底部安装的喷射环，因为这种喷射环不能保证让所有的填料颗粒都悬浮。 请按照 CHT 粉末的多少添加正确量的缓冲液。 备注：过大的搅拌或非低剪切力叶桨都可能伤害填料颗粒。这种细小的颗粒就会造成柱子反压的增高。 不要使用隔膜泵或蠕动泵反复循环填料匀浆，这种过大的物理力可能会破会填料，蠕动泵和隔膜泵将会使得填料破碎，同时也是填料损坏的主要原因。对于用这些些泵单次传送填料悬液可以最大限度的破坏填料颗粒。千万不能用于多次循环填料传送，因为高剪切力和颗粒在管路里的碰
40、撞，挤压都会加速颗粒的破坏。压力储存容器是最好的。 5.2.3 填料传送填料传送填料传送填料传送 抽吸或真空填料传送 对于一些具有马达的层析柱子可以不用泵完成调料传送， 通过马陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 30 / 70 达控制可调节高度的柱头像针管一样把填料抽吸进入柱子。这种传送可以以 200cm/hr（40umCHT）或 300cm/hr（80um CHT）线性速度迅速的完成填料传送。 介质传送工作站 介质传送工作站能够把正在搅拌的存储罐里的调料悬液转入到开放的柱子里。当介质传送工作站用隔膜
41、阀传送时，控制悬浮液浓度小于 50% V/V。更低的浓度可以确保更好的装柱效果。如果低于 15%V/V(9.5w/v)浓度对于装柱效果提高可以忽略不计。 填料装柱工作站 填料装柱工作站是通过一个含有多个管口的喷嘴把填料从存储罐中装入密闭的柱子里。当用这种方法装 CHT 时候，填料悬液浓度应低于 25% V/V（15.8W/V） 。更低的浓度可以确保更好的装柱效果。如果低于 15%V/V(9.5w/v)浓度对于装柱效果提高可以忽略不计。但是由于过度的物理力量可能会对填料造成破坏。蠕动泵和隔膜泵将会使得填料破碎，同时也是填料损坏的主要原因。更低的填料悬液浓度减少了剪切力和管路和喷嘴中颗粒与颗粒之间
42、的碰撞和挤压，最大限度的减少了对颗粒的破坏。所谓低浓度悬浮液是指低浓度于 26%V/V 或 16w/v。对于用这些些泵单次传送填料悬液可以最大限度的破坏填料颗粒。千万不能用于多次循环填料传送，因为高剪切力和颗粒在管路里的碰撞，挤压都会加速颗粒的破坏。压力储存容器是最好的。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 31 / 70 5.3 开放式柱子装柱开放式柱子装柱开放式柱子装柱开放式柱子装柱 开放式柱子是通常用于中试或小规模生产,如 ? Bio-Rad Easypack columns ? BPG col
43、umns( GE heralthcare) ? Quickscale columns (Millipore) 首先通过查看附录Tables A1-A5， 你可以确定正确的CHT使用量。该附录包含了柱管高度为 500,600,700 和 900mm，最大装填高度为 400,500,600,800mm 规格的柱子。柱管与装填高度之间 100mm高度是由于需要留出柱头的高度。 例如： 需要装 45cm 直径的柱子，最终装柱高度为 15cm， 15.03kg CHT 加入 58.6L 的装柱缓冲液中，就得到 37.5%V/V 的悬浮液。 装柱 1 调平柱子。 否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度
44、的将不能保持一致。 2 浸润底部筛板，确保没有空气。关闭底部出口阀门。 3 计算需要装柱的缓冲液体积及 CHT 重量。反复翻转 CHT 储罐使得CHT 颗粒变松，以便容易倒出。 a把装柱缓冲液倒入柱子里； b如果采用气体搅拌，把气体调到推荐的压力使得缓冲液能够轻微的搅动； c如果使用手动搅拌，用搅拌桨搅拌； 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 32 / 70 d一边搅拌，一边把 CHT 粉末倒入到缓冲液中，继续搅拌 4 CHT 完全倒入之后，用洗瓶清洗搅拌桨和柱管壁 5 把轴头放进柱管，打开入口阀，固
45、定在离液位 2cm 高位置； 6 密封轴头（O 型圈，膨胀密封圈，压缩密封圈） 。使得液体不能通过密封圈，同时又可以降低柱头。 7 可以静置 1min。降低柱头排除柱头里的气体； 8 完全密封柱头密封装置 9 打开出口阀，以 300cm/hr 流速装柱，直至柱床平稳或者使用缓冲液大约 3 倍柱体积后； 10 停止流速，关闭出口阀，保持进口阀开着； 11 降低柱头，让装柱缓冲液从柱子入口流出； 12 继续降低柱头，指导柱头降到高于 10% 目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出 0.1-1cm 高度是可接受的。 这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。 对于亚克力和玻璃柱
46、子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度 10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以 100cm/hr 线性速度装柱，同时调整马达以 50cm/hr 的线性速度提升柱头，当柱头提升 0.5cm。 13 调整操作流速继续平衡 3-5CV； 14 测试柱效。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 33 / 70 5.4 密闭层析柱装填密闭层析柱装填密闭层析柱装填密
47、闭层析柱装填 大的层析柱都是密闭的层析柱， 必须通过介质传送阀把填料传送到柱子中。可以通过多种方法把填料传送到柱子里： ? 通过泵或压力容器填料传送 ? 抽吸进入 ? 装柱工作站 5.4.1 介质转送工作站介质转送工作站介质转送工作站介质转送工作站 通过这种填料传送方式的柱子，主要包括： ? Bio-Rad Inplace columns ? BioProcess LPLC columns （GE Healthcare） 对于这种柱子，必须根据你需要的高度计算出确定的 CHT 数量， 然后把所有的填料都转运进入柱子。 1 调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。
48、2 根据柱子大小通过 Table A5 计算出所需要的装柱缓冲液体积及CHT 重量。如果需要，请留出额外的清洗泵和传送管路的缓冲液体积。 3 按计算的缓冲液体积及 CHT 重量准备介质悬液。 4 放置柱头在 Inplace 的最高处或者 Bioprocess LPLC 柱子的介质传送阀下面； 5 通过介质传送阀迅速的将填料传送进入柱子，快速的传送同时保陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 34 / 70 证填料充分混合； 6 关闭填料进口阀； 7 保持静置 1min 或者看到悬浮液有水层出现。 减低柱头
49、到悬浮液层，密闭密封圈。 8 关闭出口阀门，打开进口阀，减低柱头 2-4cm 排除上筛板和柱管的气体； 9 关闭进口阀门，打开出口阀门； 10 对于马达控制的层析柱，调整柱头速度 300cm/hr (Bio-rad Inplace column) 或者 700cm/hr（80un CHT）和 500cm/hr（40um CHT） （LPLC） 。 不要超出柱子推荐的最大压力。 11 继续降低柱头，指导柱头降到高于 10% 目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出 0.1-1cm 高度是可接受的。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力和玻璃柱子，我们可以直接看到
50、这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度 10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以 100cm/hr 线性速度装柱，同时调整马达以 50cm/hr 的线性速度提升柱头，当柱头提升 0.5cm。 12 调整操作流速继续平衡 3-5CV； 13 测试柱效。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 35 / 70 5.4.2 吸入式填料传送吸入式填料传送吸入式填料传送吸入式填料传送 通
51、过这种填料传送方式的柱子，主要包括： ? Bio-Rad Inplace columns ? AxiChrom columns（GE Healthcare） 对于这种柱子，必须根据你需要的高度计算出确定的 CHT 数量， 然后把所有的填料都转运进入柱子。建议多准备 5-10%悬浮液。 1 调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。 2 按计算的缓冲液体积及 CHT 重量准备介质悬液。 3 放置柱头在 Inplace 的最低处，柱子和辅助传送管道先用装柱缓冲液浸润，密闭柱子。 4 以 200cm/hr （40um CHT） 和 300cm/hr （80um CHT）
52、提升柱头，通过底部介质传送阀将填料传送进入柱子； 5 当达到计算的高度，停止柱头移动，关闭填料进口阀； 6 关闭柱头进口阀门，打开柱子出口阀，调整柱头速度 300cm/hr 开始轴向压缩。 不要超出柱子推荐的最大压力。 7 继续降低柱头，指导柱头降到高于 10% 目标柱高位置。柱床填料面与柱头之间留出 0.1-1cm 高度是可接受的。这个空隙主要是保证不平整的柱头表面搅乱已经装好的柱床顶部的填料。对于亚克力和玻璃柱子，我们可以直接看到这个空隙。对于不锈钢轴向压缩柱子，建议在接近目标柱高高度 10%位置时候，降低马达压缩速度，当柱头达到目标高度，触及到填料时候有一陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷
53、羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 36 / 70 个突然地抵抗力出现时，马上停止马达，关闭好出口，打开进口，使用装柱缓冲液，用泵以 100cm/hr 线性速度装柱，同时调整马达以 50cm/hr 的线性速度提升柱头，当柱头提升 0.5cm。 8 调整操作流速继续平衡 3-5CV； 9 测试柱效。 5.4.3 卸柱卸柱卸柱卸柱 不管开放式或密闭柱子，所有调节柱头柱子的卸柱程序都比较相似。 1 给 100-200cm/hr 向下流速， 同时以低于线性流速速度提升柱头维持一个正向流速； 2 直到柱头出现 5-10cm 空隙 3 降低流速
54、至 100cm/hr,同时改变流速方向由向下改为向上。 4 不断的改变流速方向，直至柱床填料坍塌； 5 释放柱头密封圈 a 对于开放式柱子，移开柱头 b 对于密闭柱子，提升柱头至最高位置 7 从柱子中移除填料 a 对于开放式柱子，用干净的器皿或隔膜泵转移出填料 b 对于密闭柱子，打开介质传送阀，用介质传送工作站移出填料 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 37 / 70 5.5 装柱工作站装柱工作站装柱工作站装柱工作站 装柱工作站主要用于固定柱头或半移动柱头的密闭层析柱，如： ? Chromaflow
55、 column( GE Healthcare) ? Resolute column (Pall) ? IsoPak column (Millipore) ? Eastern Rivers column 附录 Table A.5 列出了直径 40-240cm，装柱高度为 10-20cm的密闭柱子所需 CHT 数量。这种柱子一般柱管高度 50cm，柱头固定在 5-40cm 高度。 装柱： 1 调平柱子。否则装好的柱子的填料平面与柱头之间空隙高度的将不能保持一致。 2 设定好柱头的高度； 3 根据不同柱子密封好柱头； 4 把介质传送系统，柱子充满装柱缓冲液，把柱子和管路里面空气去除干净。 5 按计算
56、的缓冲液体积及 CHT 重量准备介质悬液。反复翻转让CHT 变得分散而容易倒出。 a 倒出预算数量的装柱缓冲液至容器罐中； b 参考 5.2 方法搅拌缓冲溶液； c 把计算好的 CHT 粉末倒入到储存罐中，搅拌 5min 6 根据柱子和装柱工作站压力的最大耐压，调整压力用最快的陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 38 / 70 速度把 CHT 悬浮液通过上面的喷嘴打入到柱子中 a 根据产品说明书，一直到装柱工作站停止； b 关闭柱子出口阀； 7 关闭工作站喷嘴，按照产品说明书立刻清洗相关管路； 8 以
57、操作流速用装柱缓冲液平衡 5CV； 9 测试柱效。 最佳做法： 对于大于 200L 的填料悬浮液，用低剪切力的水翼叶轮搅拌。不要用传送泵搅拌和混合填料。 对于密闭柱制造商推荐装柱后反冲，可以移除柱子进口的气泡。但是对于羟基磷灰石装柱，我们不推荐装柱后反冲。 卸柱 请按照下面的指导原则拆柱。 对于 CHT 仔细计划拆卸和重装的策略。高浓度，长时间搅拌，反复的搅拌和反复装柱都会引起 CHT 颗粒不可逆的破坏。 介质装填设备仅用于让装好的 CHT 填料疏松，导入填料罐。不要用收集的填料悬浮液在循环到柱子里。 不要让填料残留在装柱工作站，管路和喷嘴里。如果发生了残留，必须拆掉被堵的部件。拆卸程序如下：
58、 1 准备一个 10 倍柱体积容器。例如：如果需要拆 100L 的柱子，陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 39 / 70 需要 1000L 的容器； 2 设置两个喷嘴“Unpack”; 3 使用装柱泵把缓冲液（测试或装柱缓冲液）泵入柱子和收集填料； a 最好使用填料罐收集填料悬浮液；不是容器经常比较小。 1） 如果这种情况，拆卸柱子至填料罐体积； 2） 每次拆卸，停止泵，关闭喷嘴，清洗 CHT 填料管路； 3） 把 CHT 传送到填料罐中： 对于 40um CHT 传送速度180cm/hr；对于 8
59、0um 大颗粒 CHT 速度设置 1000cm/hr; 4） 把填料吸入到填料罐里。 b重复步骤 3 直至缓冲液中看不到 CHT 颗粒。移除填料悬浮液上面的颗粒。 4 按照制造商的指导清洗柱子。 5.6 柱效测试柱效测试柱效测试柱效测试 在装柱后直接测试柱效。以后可以再固定时间段，或者当分离性能有所下降的时候，可以测柱效。柱效测试主要是测试装柱效果和监测柱子的使用寿命。 柱效可用 HETP(等同于理论塔板数的高度)和对称因子（Af）来监测装柱的效果。柱效通过注入 2%丙酮和 1M NaCl 作为测试缓冲液来检测。 最好的平衡缓冲液是 0.15M NaCl，20Mm PB, Ph 7.2-8.0
60、. 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 40 / 70 测试体积最好为 1-5%柱体积。流速为 75-150cm/hr，但是每次测试的要保持一致。 超出此范围的流速对于某些过程也可以接收， 然而，Af 和 HETP 测试结果不是最佳。 如果已经定义了柱效接收范围， 柱子理论大塔板数可以作为装柱使用的一个接受标准。为了避免样品稀释，尽量接近柱头，但是不要影响流速。 按照下面的步骤开始平衡柱子： 方法 1： 1 用测试缓冲液平衡 3-5CV, 流速：75-150cm/hr。 2 记录柱子压力. 测试条件：
61、 ? 样品体积：15%柱体积 ? 样品浓度：2% v/v 丙酮 或 1.0M NaCl 备注：当用 NaCl 时，确保注射样品保持与平衡缓冲液一致的磷酸浓度。 流速： 75-150cm/hr UV:280nm, 1cm,0.1AU(丙酮) 电导：100mS（NaCl） 方法 2*： 1 用 0.1 N NaOH 平衡 3CV, 流速 150cm/hr； 2 用 0.1M NaCl 平衡 3CV, 流速 150cm/hr. 测试条件 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 41 / 70 ? 流速：150c
62、m/hr ? 样品体积：0.025 CV 1M NaCl ? 继续 0.1M NaCl 平衡 3CV ? 停止，计算测试结果 备注： 该方法先用 NaOH 平衡是为了避免别的平衡缓冲液电导干扰。该方法是由 Chugai Pharmaceutical Co 研发。 按照下面公式计算柱子 HETP 和 RPH（平均塔板高度） （图 5.3） ： HETP=L/N L: 柱床高度（cm） N：5.54（Ve/W1/2）2 Ve:洗脱峰距离 W1/2：半峰高位置峰宽 Ve，W1/2 需要使用相同的测试单位 RPH=HETP/d d:填料的平均颗粒大小（cm） 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石
63、陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 42 / 70 40um CHT HETP 范围 0.016-0.021cm， 80um 范围 0.032-0.041cm。 RHP 经常用来比较柱子的性能。 对于坚固，不可压缩的层析填料， RPH值小于 5.5 通常都可以接受。 峰的对称因子 Af 计算: Af=b/a a: 10% 峰高时前半部分峰宽 b：10% 峰高时后半部分峰宽 对称因子应该尽量接近 1.0.8-2.3 通常都可以接受。 使用过程中，峰形的改变通常提示柱子开始变坏。 5.7 装柱装柱装柱装柱 下面的提示可以帮助你更好的完成装柱。 5
64、.7.1 对于可以调节柱头的柱子对于可以调节柱头的柱子对于可以调节柱头的柱子对于可以调节柱头的柱子 如果柱效测试对称因子大于 2.3，而 HETP 或 RPH 可接受，可能陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 43 / 70 是柱头降到的太多， 可能紧紧的压缩到填料， 但是对于柱壁压缩不够。对于可以调节柱头，如果没有压缩到建议的柱床高度，柱子装好后就可能发生这样的现象。 这种情况如果按照操作指南压缩到预订高度酒可以解决。 如果柱效测定对称因子可以接受，而 HETP 或 RPH 太大，柱头没有足够空间向下
65、面移动。这种现象对于孔径不均匀的滤网经常发生。你可以每次降低 0.5cm 重新测试柱效。如果不行，继续按每次降低0.5cm 测试柱效，直至 HETP,RPH,Af 都在可接受范围之内。 5.7.2 对于靠压力的密闭柱子对于靠压力的密闭柱子对于靠压力的密闭柱子对于靠压力的密闭柱子 如果柱效结果达不到要求，请根据该指南重新装柱。这种现象经常是由于装柱过程中产生了渠道，造成柱床不均一，或者柱中有太多的气体。 5.7.3 对正在使用的柱子柱效评估 如果柱子使用了很多次， 已经发现了破坏的现象， 比如压力升高，HETP,RPH 增加 和/或 Af 变差。我们推荐你更换填料。 5.7.4 调节柱子进行工艺
66、开发调节柱子进行工艺开发调节柱子进行工艺开发调节柱子进行工艺开发 如果柱子用推荐的缓冲液测试柱效， 可以直接开始条件筛选建立纯化工艺。 当你使用 pH 大于 8 的缓冲液，或者装柱缓冲液 pH 大于 8， 请用 200mM 磷酸盐， pH 6.5-6.8 平衡 3CV， 然后再开始进行工艺摸索。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 44 / 70 5.8 实验室规模装柱实验室规模装柱实验室规模装柱实验室规模装柱 请参考 5.8.1 和 5.8.2 装柱，柱床高度 20cm。 5.8.1 Millipo
67、re Vantage L 柱子柱子柱子柱子 下面装柱主要针对Millipore Vantage L柱子装40um和80um CHT的装柱：11mm250mm，16mm250mm，22mm250mm，32mm250mm，44mm250mm。 1 插入和固定柱子出口密封圈， 支撑板。 调节恰当的延长头高度； 2 加水浸润支撑板和冲洗出口管道。 对于 11mm 柱子， 用 3ml 水。对于 16mm 柱子，用 4.5ml 水。对于 22mm 柱子，用 6ml 水。对于 32mm柱子，用 9ml 水。对于 44mm 柱子，用 12ml 水。 3 完全排空。 4 用 1/4 -28 堵头堵住出口。 5
68、把有延长柱头的柱子固定在架子上，确保水平。 6 加入水至筛板上 0.5cm； 7 称量 88g NaH2PO4 2H20， 367 g Na2HPO4 7H2O,配制 400mM 磷酸盐再生缓冲液，用 0.2um 膜过滤； 8 在烧杯中按照下面表格混合再生缓冲液与水， 配制装柱缓冲液（见表 5.1） 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 45 / 70 9 称量 CHT: 11mm 柱子称量 11.97g，16mm 柱子称量 25.3g，22mm柱子称量 47.9g，32mm 柱子称量 100g，44m
69、m 柱子称量 192g， 10 把称好的 CHT 倒入装柱缓冲液中，边倒边用塑料压舌板搅拌； 11 把 CHT 悬浮液倒入柱子； 12 沉降约 5min，移去 1/4-28 堵头； 13 让缓冲液流干，约 5min； 14 把出口堵上； 15 用水把柱壁上的 CHT 冲洗干净； 16 放入支撑板和柱头密封圈； 17 把安装好的柱头插入柱子上，固定好； 18 连接柱头至层析系统； 19 移去堵头，把出口与层析系统连接； 20 用 150cm/hr 流速压柱 15min：对于 11mm 柱子，用 2.4ml/min, 对于 16mm 柱子，用 5ml/min, 对于 22mm 柱子，用 9.5ml
70、/min, 对于32mm 柱子， 用20.1ml/min, 对于44mm 柱子， 用 38ml/min. 21 停止泵让压力降到常压； 22 堵住出口； 23 拧下进口管路，松开进口调节锁； 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 46 / 70 注意：下面操作带上乳胶手套。 24 移除延长管的缓冲溶液及延长管； 25 把柱子从柱夹上取出； 26 握住柱子，把柱头放入柱管，浸入缓冲液中； 27 排除气泡； 28 继续按压，直到柱头离填料面 2mm 高处停止； 29 锁住调解锁； 30 用水清洗柱子外表面；
71、 31 擦干外表面； 32 固定柱子在柱子夹上； 注意：下面步骤可以避免把气泡带入装好的柱子。 33 设置流速 1ml/min； 34 开始泵把管路充满； 35 停止泵，链接管路至柱子进口； 36 拧紧进口管路，保证紧密密封； 37 移去出口堵头，连接到系统； 38 设计流速 150cm/hr（最大流速 300cm/hr） 。对于 11mm 柱子，用 2.4ml/min, 对于 16mm 柱子， 用 5ml/min, 对于22mm 柱子，用 9.5ml/min, 对于 32mm 柱子， 用 20.1ml/min, 对于 44mm 柱子，用 38ml/min. 39 启动泵，平衡 15min；
72、40 停止泵； 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 47 / 70 41 顺时针转动调节柱头至填料层上 1mm。 注意：调节柱头不要接触柱床。如果接触填料，轴向的旋转将破坏颗粒。 5.8.2 Econo 柱装柱柱装柱柱装柱柱装柱 下面的装柱流程是针对 Bio-Rad 的 Econo 层析柱： 1.0cm30cm（737-1032）和 1.5cm30cm （737-1532） 。该层析柱子需要配置流速连接头（flow adapters） 1.014cm (738-1015)和 1.514cm (738-
73、1016)，装柱漏斗（731-0003）和 Luer 接头才能连接到层析系统。该过程主要用于装 CHT I 型和 2 型的 40um 和 80um。 装柱前注意事项： Econo 层析柱最大耐压越 14psi（1bar） 。该流程中仅为建议流速，具体的流速需要根据你的应用选择恰当的流速。 对于装柱床高度为 20cm 柱子，40um CHT 限速流速约 50cm/hr，对于 80um CHT 限制流速余额 90cm/hr。根据上面的建议，实际应用你需要调节至更小流速。 对于柱子层析过程产生的压力， 柱子出口的压力在选定流速下不能超过 1bar。 我们不推荐用 2.5cm 或 5.0cm 直径的
74、Econo 柱子装 CHT。 1 添加水浸润支撑板和冲洗出口管道。对于 1.0cm 柱子，用 3ml水。对于 1.5cm 柱子，用 5ml 水。 2 用 Luer 接头堵住出口 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 48 / 70 3 把柱子固定在柱子固定架上，确保柱子水平。连接管路至柱子进口。 4 加入至筛板上 0.5cm； 5 按表 5.2 在烧杯中混合再生缓冲液和水制成装柱缓冲液； 6 称量 CHT: 1.0cm 称重 9.9g；1.5cm 称重 22.3g； 7 把 CHT 倒入到装柱缓冲液中，
75、边倒边用压舌板搅拌； 8 把混合均匀的 CHT 悬浮液倒入放在柱子上的漏斗里； 9 静置 1min，移去 Luer 塞子； 10 排空缓冲液，定期用注射用水清洗 CHT； 11 不断的排空，直到缓冲液层高于填料层 3cm； 12 拧入 Luer 接头停止排空； 13 按照 Econo 层析流速连接头操作指南 3.1（M7380014）安装和调节流速调节头。 14 按照 Econo 层析流速连接头操作指南 3.2 提到的 4-7 步骤插入流速连接头，直到柱头的高度至填料面上面 1mm 处； 15 把柱头入口与层析系统连接； 16 移除 Luer 接头，把柱子出口连接到层析系统； 陶瓷羟基磷灰石陶
76、瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 49 / 70 17 按照下面的推荐流速和 3.3.10-14 推荐的循环次数装柱： A 对于 40um CHT,使用 50cm/hr 线性流速： 1.0cm 柱子，流速0.65ml/mim，1.5cm 柱子，流速为 1.5ml/hr。 b 对于 80um CHT,使 190cm/hr 线性流速： 1.0cm 柱子，流速2.5ml/mim，1.5cm 柱子，流速为 5.6 ml/hr。 备注：我们不推荐使用 GE XK 柱子装填 CHT。因为 CHT 颗粒经常堵塞在柱壁与接头和筛网
77、环之间造成柱效不好。 第六章第六章第六章第六章 实例分析实例分析实例分析实例分析 本章节介绍在工业生产中如何在不同类型柱子中装填 CHT，请认真阅读。 当你在装填柱子时候，请考虑不同柱子的性能及差异。 6.1 装柱装柱装柱装柱GE Chromaflow 900/200-400 目标 对于 Chromaflow 层析柱，直径 90cm， 装柱高度 35cm，需要 222L Type 2 40um CHT.使用 700L 容器，装 510L 填料悬浮液，填料悬浮液为 45%V/V（28% w/v）,装柱缓冲液 200mM 磷酸钠，pH 7-9. 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷
78、灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 50 / 70 填料悬浮液制备 灌注 400L 磷酸缓冲液到储存罐里，通入氮气搅拌 10min。用 10L缓冲液把各管路充满。 添加 145kg CHT 到 390L 磷酸缓冲液中（大约比预期的装填量多3%） ，全部倒入 CHT 后继续搅拌 10min，关闭和密闭柱子盖子。 装柱 用氮气给储存罐 45psi 压力，保持 1min。打开储存罐至柱子的阀门，维持 45psi 的压力直到装柱喷嘴停止。立刻关闭喷嘴。 清洗 关闭储存罐阀门，释放气压。把管路从柱子进口卸下来连接到收集罐上。打开储存罐阀门，清空多余的填料。关闭氮
79、气管路。使用罐的喷淋系统用水清洗罐的内部，收集清洗液到收集罐中。 连接柱子进料管路到接 GE Chromaflow Pack 50 装柱工作站。更加说明书要求清洗进料管路。 柱效测试 把柱子连接到层析系统。以流速 25cm/hr，磷酸盐缓冲液反冲5min，把柱子筛网中气体排出。以流速 170cm/hr，磷酸盐缓冲液正向平衡柱子至 pH 和电导至基线（压力大约 38psi） 。 注入 5.55L 2% 丙酮（磷酸盐缓冲液）为测试样品，以 100cm/hr流速，测试柱效，约需要 350L 测试缓冲液。 结果 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用
80、及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 51 / 70 6.2 装柱装柱装柱装柱-Prototype Millipore IsoPak IP P350/500 目标 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 52 / 70 使用 IsoPak 装柱系统能够完成：1）完成 CHT type 1 40um 和80um 装柱； 2） 得到好的柱效 3） 在大量填料破坏前可以装多少次。 填料悬浮液制备 CHT 1 型 40um，80um 悬浮液通过流速装填建立填料基线和相关装填 CV。悬浮液在柱子里用 200mM
81、磷酸盐缓冲液（pH8-9）混匀转移到有 45 度锥形角的聚丙烯储罐中，浓度约为 25%v/v。然后用磷酸盐缓冲液稀释至11-14% v/v。 在用IsoPak装柱前用聚丙烯桨搅拌均匀。 柱子准备 清洗，干燥 IPP350 装柱工作站，把体积调整到小于 5%总 CHT 悬浮液体积。 通过空气让储罐的管子回流确保有没有任何 CHT 滞留在管路里。装柱管路连接到装柱工作站底部的装填阀门。进口连接设置为流出模式，底部装填阀打开。 装柱 装柱工作站设置为 30psi，装填开始。填料从底部填充进柱子，通过入口的筛板排空气和多余的磷酸盐缓冲液。 柱床积累至筛板并且从高到底增加。完成装填后，停止系统。底部装填
82、阀关闭。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 53 / 70 清洗 按照柱子及装柱工作站说明书清洗底部装填阀和管路。 柱效 柱子连接到层析系统上。 流速 200cm/hr， 用测试缓冲液 （75Mm 磷酸钠+100mM NaCl， pH 7.4）平衡 2.6CV。 测试样品：500ml 2% 丙酮 磷酸盐缓冲液， 10 秒内完成上样 结果 CHT type 1 （40um 和 80um）能够用装柱工作站有效的装填到IsoPak IPP350 柱子里。IsoPak 方便可控，节省装卸的时间。而且IsoP
83、ak 泵装填的结果也是非常好。然而，经过装柱工作站 40 循环之后，填料反压会增加 15-18%，可能提示 CHT 在经过反复的装和重装之后容易破碎。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 54 / 70 附录附录附录附录 A1 CHT 与与与与 缓冲液表缓冲液表缓冲液表缓冲液表 表 A1-A5 显示了柱管高度为 500,600,700,900mm， 最大装填高度分别为 400,500,600,800mm 的 CHT 及缓冲液量化表； 柱管高度与最大装填高度相差 100mm 是用于放置柱头。 表 A1-
84、A5 列出了装填相应直径和高度柱子准备填料悬浮液所需要的 CHT 干重及缓冲液量。表 A5 是针对封闭式操作柱子，内径从 40cm-240cm，装柱高度 10-20cm。常用的柱管为 50cm，进口柱头固定在某一高度，从 5cm-40cm。 例如 BPG 450/500，内径 45cm 如果需要装 15cm 高度就需要15.03kg CHT 和 48.6L 装柱缓冲液最终悬浮液浓度为 37.5%。柱管高度为 500-600mm 一般装柱高度不要超过 20cm。700mm 柱管不要超过25cm，900mm 柱管不要超过 30cm。 对于在表格中没有涉及的柱子，可以用下面公式计算： VL=（Vb/
85、S）-0.210Vb VT=（Vb/S） VL：添加缓冲液体积 VT：悬浮液终体积 Vb：装柱体积 S：填料悬浮液浓度（%V/V） VT 确保准备的悬浮液总体积可以符合柱子或填料缓冲液容器体积。Bio-Rad 推荐填料悬浮液浓度 S50%.装柱用的 CHT 密度为陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 55 / 70 0.63g/ml，见 2.1,。根据经验，对于大柱子装填，用 0.60g/ml 密度计算可能更接近最后预设的装柱高度。 注意： 装柱后的大的震荡， 如柱子从一个地方移动到另一个地方，都可以能
86、引起填料的进一步调整。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 56 / 70 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 57 / 70 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 58 / 70 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 59 /
87、 70 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 60 / 70 A2 EDTA 络合滴定测定络合滴定测定络合滴定测定络合滴定测定 CHT 流出液中钙离子浓度流出液中钙离子浓度流出液中钙离子浓度流出液中钙离子浓度 CHT 是一个混合机制的填料，广泛用于蛋白和抗体的纯化。CHT经过烧结形成了 Ca10（PO4）6(OH)2，是一种磷酸钙化合物。当 pH 在酸性环境下(pH7.0)，CHT 的溶解性就会增加，溶解后形成了离子形式（Ca2+， PO4-,OH-） .因此， CHT 的溶解性可以通过测定钙离子， 磷
88、酸根，或氢氧根浓度来评估。对于这三种离子，钙离子的定量响度简单，可以通过络合滴定检测（Belcher et al.1958,Kim and Vipulanandan 2003）.下面描述用 EDTA 络合滴定定量 CHT 柱子流出液中钙离子浓度。 该方法已经做了修改以便同时应用于低浓度或高浓度缓冲液样品，这种现象在实际纯化过程中都会经常遇到。 实验过程 1 调节样品 pH 在开始滴定前，样品的 pH 要调节到 100.1。根据样品中离子浓度，pH 可以按下面方法调整： a) 低浓度含量样品（10mM） 可以仅用氨水缓冲液（solution C）调整。不同样品需要氨水的量是不一样的，所以需要添加
89、氨水同时监控 pH 变化。 b）高浓度含量样品（10mM） 推荐首先用 10N NaOH 把样品调整到中性，然后用 solution C调整到 100.1。 2 添加 WEBT 溶液 当样品 pH 调整节到 100.1， 添加工作指示溶液 （WEBT solution） 。陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 61 / 70 通常每毫升样品添加 2-3ul。 3 滴定 当 WEBT 溶液完全溶解，样品变成了粉红色，可以滴定。滴定前先记录 EDTA 滴定液体积（V1） 。滴定过程中要监控样品颜色的变化。当
90、样品颜色由粉红色变成紫色，然后变成了深蓝色，最后变成了天蓝色（end point） ，停止滴定。 结束点颜色可能会发生逆转， 特别是钙离子浓度大于 5ppm 的时候。因此，推荐你观察到结束点颜色时候，至少等 2min 后，再读和记录最后滴定液的体积（V2） 。 4 钙离子浓度计算 样品体积 100ml： 1ppm Ccalcium=-（V2-V1） 0.25ml titrant V1： 滴定前滴定液体积（ml） V2: 滴定前滴定液体积（ml） Ccalcium: 总钙离子浓度(ppm) 样品体积 40ml 1ppm Ccalcium=-（V2-V1） 0.1ml titrant V1： 滴定
91、前滴定液体积（ml） V2: 滴定前滴定液体积（ml） Ccalcium: 总钙离子浓度(ppm) 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 62 / 70 材料与方法 材料： Eriochrome Black T（EBT,铬黑 T） Triethanolamine（TEA,三乙醇胺） NH4Cl MgSO4H2O NH4OH EDTA disodium dihydrate(Na2EDTA) 10 N NaOH 1 N HCl Deionized (DI) water (water)( 18/cm) 滴定溶
92、液 氨水缓冲液 Solution A: 称量 1.179g Na2EDTA，750mg MgSO4H2O，去离子水溶解，定容至 50ml，贴上标签 Solution A。 Solution B：称量 16.9g NH4Cl，溶解在 143ml 氨水中。贴上标签solution B。 Solution C：把 solution A 与 solution B 在 250ml 倒入 250ml容量瓶中，去离子水定容至 250ml。 0.01M EDTA(Titrant) solution 称量 3.723g Na2EDTA，用蒸馏水溶解并且定容至 1000ml。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基
93、磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 63 / 70 EBT(Indicator) solution Stock solution 称量 1g EBT 和 100ml TEA.混合一起，贮藏。贴上标签 EBT Stock. Working Indicator（WEBT）solution 用去离子水按 1 :4 稀释 EBT stock.贴上标签 WEBT。 仪器与 设备 ? 25 ml 滴定管 ? 移液管 ? 150 ml 烧杯 ? 250ml 容量瓶 ? Teflon 处理的磁力搅拌子 ? 磁力搅拌器 ? pH 计 提示： 样品 pH
94、调节 ? 10N NaOH 用量基本在 0.1-1ml； ? 对于 solution C， 在用 NaOH 调至中性后，至少需要 0.1ml氨水调至 100.1。 ? 如果 pH 调节高于 100.1，可以用 1 N HCl 回调。 添加 WEBT solution 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 64 / 70 ? 添加 EBT 溶液后， 会出现粉色。 颜色的深浅取决于钙离子浓度和 EBT 和氨水的体积。 滴定 ? 对于 100ml 样品，0.25ml EDTA 溶液滴定 1ppm 钙离子； ?
95、 为了试验测试的精确度，特别是低浓度钙离子，建议使用100ml 样品测试。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 65 / 70 A3 参考文献参考文献参考文献参考文献 A4 其他资料其他资料其他资料其他资料 A5 订货信息订货信息订货信息订货信息 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 66 / 70 A6 常见问题常见问题常见问题常见问题 1 陶瓷羟基磷灰石（CHT）主要的优点是什么？ CHT 是混合机制层析填
96、料，独特的选择性可以分离性能相近的分子。同时允许使用更宽泛的分离条件。CHT 可以在含有尿素和别的促溶剂情况下仍然可以结合蛋白。 2 CHT 可以使用什么缓冲液？ 常用的结合缓冲液是用 5mM 磷酸盐， pH6.8。 碱性蛋白可以用 pH 7.2，含 1M NaCl 磷酸盐缓冲液线性或阶段洗脱。 酸性蛋白可以用 500mM 磷酸盐缓冲液线性或阶段洗脱。至关重要的是，不管结合和洗脱缓冲液pH 都要高于 pH 6.5. 3 如果在推荐的缓冲液中都不结合或不能被洗脱怎么办？ 很少一些蛋白在 5mM 磷酸盐不结合， 或者不能被 500mM 磷酸盐洗脱下来。如果出现这种情况，可以降低 pH 或减少磷酸盐
97、浓度至 1mM,但是pH 一定要维持在 pH6.5 以上，并且在缓冲液中添加钙离子。但是需要注意，使用低于 5mM 磷酸盐将会导致柱子寿命减少。CFT 可以用于pH6.0 缓冲液纯化蛋白。洗脱不需要更高的磷酸盐。 4 CHT Type 1 与 type 2 有什么差别？ CHT Type 1 与 type 2 化学结构完全一致，主要是烧结温度不同，造成两者孔径和比表面积不用。不管酸性蛋白和碱性蛋白，CHT type 1 有高的载量。CHT type 2 更好的结合碱性蛋白，对于酸性蛋白有低选择性。 5 磷酸钠与磷酸钾缓冲液有什么区别？ 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层
98、析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 67 / 70 不管磷酸盐或磷酸钾缓冲液，CHT 都能发挥很好的性能。然而，应该避免使用无水磷酸钠，因为可能包含焦磷酸盐，这样会减少填料的载量。 6 在使用 CHT 的时候，应该避免使用哪些缓冲溶液？ 所有的缓冲液中都要包含 5mM 磷酸盐，pH 都要等于或高于 6.5.缓冲液如果包含螯合剂，pH 低于 6.5，与磷酸根结合而产生低溶解化合物的金属离子，都会对 CHT 造成破坏。大量使用纯化水清洗也会造成CHT 慢慢的溶解。不推荐 1M NaOH 清洗后立刻用高磷酸盐再生，建议高磷酸盐和 1M NaOH 步骤之间加入至少
99、1/2 CV 水。当使用含钙离子的缓冲液，在换成高浓度磷酸盐洗脱前，要用无钙离子缓冲液清洗3CV。除此之外，在洗脱之后和高磷酸盐清洗之前使用低磷酸盐缓冲液清洗 3CV，有助于延长 CHT 使用寿命。 7 如何延长 CHT 填料寿命？ 在所有缓冲液中，包括贮藏液，都包含 5Mm 磷酸盐，pH 都要等于或高于 6.5.对于所有应用尽量选用高 pH 缓冲液。添加 ppm 级别的钙离子可以提高填料的坚固度。当第一次使用 NaCl 洗脱时，由于氢离子的脱落，将会引起 pH 降低，因此添加 co-buffer，如 MES,将大大提高填料坚固度。除此之外，Bio-Rad 发明的专利技术 SNS（表面中和系统
100、）可以消除 pH 降低。总是用 500mM 磷酸盐再生，去除吸附的蛋白， 可以贮存在 0.1M NaOH 中。 如果 NaOH 浓度低于 0.1M,请添加 5mM磷酸盐。用 NaOH 保存柱子阻止碳酸盐沉淀在柱子表面。避免突然地改变流速减少压力冲击，压力冲击将破坏柱床。 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 68 / 70 8 装柱的时候需要重点注意什么？ 因为 CHT 填料是不可压缩的，当柱子装好后，要保持柱床稳定。在装柱过程中，剪切力很容易破坏颗粒。为了避免破坏，装柱时候用 30%浓度悬浮液或不超过
101、 50%浓度，使用低剪切力的叶轮混合填料，使用隔膜泵传送填料悬浮液。在装柱之前确保柱子水平。当没有气体辅助混合时候，在柱子里混合 CHT，要使用最小的力量轻轻的混合。对于40um CHT，使用 10-13um 的筛板，对于 80um 的 CHT，使用 20um 的筛板。使用流速装柱而不要使用重力沉降装柱。柱头不要接触到填料。参考各自柱子的说明书获得更好的帮助。 9 什么引起 CHT 变色，如何避免？ 金属离子， 如铁离子， 镍离子， 都能不可逆的结合到 CHT 上一起变色。这种变色不一定会影响柱子的性能。 可以用增加 CHT 保护柱让样品或缓冲液中离子浓度最小，或者添加微摩尔级别的钙饱和 ED
102、TA 到可疑的溶液中。 这是唯一的在 CHT 上使用 EDTA 的。 10 CHT 装柱 HETP 和对称因子推荐是多少？ 当使用磷酸盐平衡，使用 2.5% 1M NaCl 作为测试样品，直径大于 5cm的柱效，对于 40um，HETP 范围为 0.016-0.021cm， 80umCHT， HETP范围为 0.032-0.041cm. 对称因子为 0.8-2.3 之间都可以接受。 11 为什么小直径柱子很难获得理想的 HETP 和对称因子？ 因为 CHT 是坚固的，相对大柱子而言，小于 2.5cm 的柱子很难有效的装填。 12 CHT 使用寿命是多少？ 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷
103、灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 69 / 70 如果正确的装填，同时维持 pH 高于 6.5， CHT 至少可以使用 40 个循环。 如果小心的避免填料被破坏， CHT 可以反复装填 25 次或更多。 13 CHT 的保存期限是多久？ 密闭存储，4-30，可以保持 5 年。装好的柱子，0.1N NaOH 密闭保存，室温，可以保持 2 年以上。 14 哪个型适合核酸纯化？ 两种型号的 CHT 都可以用于核酸去除和质粒纯化。DNA 级别晶体羟基磷灰石也推荐用于如单链，双链 DNA 分离。 15 Co-buffer 怎样影响洗脱缓冲液中的盐
104、浓度？ 对于许多 co-buffer，酸形式首先被形成，溶解用 NaOH 滴定到最终pH。在这个实例中，如果洗脱液中盐浓度在 co-buffer 研究前已经确定，NaCl 的浓度可能需要减少，因为 Co-buffer 中和过程自身会产生一些盐。 16 如果 0.5M 磷酸杨不能完全清洗调料，该怎么办？ 用更高浓度额磷酸钾。 （翻译： 李继东） 陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石陶瓷羟基磷灰石层析层析层析层析应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册应用及放大手册 70 / 70 声明： 1 该中文翻译仅作为应用参考和交流， 具体请参考 Bio-Rad Bulletin 6086：Ceramic Hydroxyapatite Application Guide for Process Development and Scale-Up 2 如有任何翻译的问题，欢迎讨论和指正。 联系人：李继东 189 3868 0096 E-mail :jidong_libio-
