阪崎肠杆菌检验

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1、阪崎肠杆菌检验,庞杏林 广州市疾病预防控制中心 Guangzhou Center for Diseases Prevention and Control,简 介,阪崎肠杆菌( Enterobacter sakazakii ) 分类在肠杆菌科，肠杆菌属， G-b，无芽胞，有周身鞭毛，兼性厌氧，棒状或球杆状，长 0.66.0m，宽 0.31.0 m。 生长特性：经过适宜的条件培养后在营养琼脂或血平板上形成圆形，光滑，突起，直径 23 mm，黄色菌落，黄色素在 25 时更为明显。 生化特性与阴沟肠杆菌相似，故1980年以前被称为黄色阴沟肠杆菌，后更名为阪崎肠杆菌。,简 介,自然界分布广泛，在水、土壤

2、、食物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到72持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 常见于生产婴儿配方奶粉的设施和家居环境中。,奶粉？隐形杀手？,简 介,危害性：阪崎肠杆菌已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌,简 介,阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对人体健康产生危害,成年人感染常为轻度的胃肠道症状。 新生儿(出生28天或以下)和不足2个月的婴儿，尤其是早产儿、体重不足2.5公斤和免疫力较弱（母亲HIV）的婴儿的感染风险最高。可致严重脑膜炎，败血症，小肠结肠炎，死亡率可高达50%80%。 新生儿(尤其是早产婴儿)胃的酸性较成年人低（PH高），这

3、可能是阪崎肠杆菌可在婴儿体内生存的一个主要因素。,简 介,1961年，英国的Franklin等人首次报道了2例阪崎肠杆菌脑膜炎，此后相继出现阪崎肠杆菌致人类感染的散发和暴发的病例报告。 统计到2004年，全球各地报道的确诊病例在60例以上，导致多起商业婴儿配方奶粉被广泛召回。,简 介,微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。 以下3 种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染: A 通过生产婴儿配方奶粉的原料; B 在巴斯德杀菌后,配方粉污染或其他添加 剂干粉带入; C 喂养婴儿前被污染,简 介,2002年美国FDA在本土某些国际乳业

4、巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌。 2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉。 阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点，得到世界多国相关部门的重视。,简 介,2005年以来，广州、中山、汕头检验检疫部门在食品工业用进口奶粉中已多次检出阪崎肠杆菌。 2008年10月17日，产自台湾的9.62吨配方奶粉从香港入境时被检验出阪崎肠杆菌超标 。不合格奶粉包括味全婴儿配方奶粉、味全幼儿成长配方奶粉和味全较大婴儿配方奶粉。,简 介,阪崎肠杆菌的检验方法？标准化？,简 介,美国食品和药品管理局(FDA)的检测方法是国际检测阪崎肠杆菌的标准生化方法。

5、此外，还有依据该菌生理生化特征的鉴定方法和PCR法检测及荧光PCR等分子检测方法。 2008年11月国家标准出台前，我国只有行业标准。,简 介,2005-5-20中国检验检疫科学研究院和天津出入境检验检疫局牵头完成奶粉中阪崎肠杆菌检测方法行业标准。 该标准建立了阪崎肠杆菌改进的传统检测方法(经典方法)、普通PCR方法和荧光PCR方法(快速筛选方法)，其中改进的传统方法与FDA方法比较，检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短1/31/2。,简 介,2006年2月，国际标准化组织(ISO)和国际乳品联盟(IDF)联合公布了“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”方法，即ISO/TS 22964 IDF/R

6、M210,简 介,2008-11-21，中华人民共和国卫生部联合国家标准化委员会发布GB/T 4789.40-2008食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验， 2009-03-01实施。 这项标准的出台，解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无国家标准检测方法的问题。,适 用 范 围,规定了食品中阪崎肠杆菌的检验方法 适用于婴幼儿配方食品，乳及乳制品，及其原料中阪崎肠杆菌的检验,设备和材料,微生物实验室常规灭菌与培养设备 冰箱25、水浴箱44 +0.5 、感量0.1g天平、振荡器、均质器 无菌吸管10ml，0.1ml，微量移液器，吸头,设备和材料,无菌锥形瓶100ml200ml2000ml 90

7、mm直径无菌培养皿 PH计或精密PH试纸 VITEK全自动微生物鉴定系统（可选用其他等效设备代替),培养基和试剂,缓冲蛋白胨水BPW（略） 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素mLST-Vm 成分和配制方法见附录A.2，加入万古霉素目的是抑制革兰阳性细菌等杂菌的生长 注意：新鲜配制的mLST-Vm应该24h内使用，万古霉素溶液可在4 保存15d,培养基和试剂,阪崎肠杆菌显色培养基DFI 附录A.3，由英国Oxoid公司提供，也可用同等效果的产品替代。 原 理： DFI中含有胆盐抑制革兰氏阳性菌，同时显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D 葡萄糖苷则与阪崎肠杆菌中的-葡萄糖苷酶发生反应，水解底物

8、，释放出5-溴-4-氯-3-吲哚基显色基团，在深黄色平板上产生绿-蓝绿色的菌落。 注意要避光4 保存,微生物 菌落颜色 阪崎肠杆菌 蓝绿色 大肠菌群 无色菌落 金黄色葡萄球菌 被抑制不生长,阪崎肠杆菌显色培养基DFI,培养基和试剂,胰蛋白胨大豆琼脂TSA （略） API 20E（也可选用其他等效鉴定试剂代替) 氧化酶试剂A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基A.7 L-精氨酸双水解酶培养基A.8 糖类发酵培养基A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基A.10,第一法 阪崎肠杆菌的检验,检验程序,检样100g(100ml)+BPW900ml,1ml+mLST-Vm 10ml,DFI琼脂

9、,挑取蓝绿色菌落,TSA,挑取黄色菌落,生化鉴定,报告,36 + 1 ，18h + 2h,44+0.5 ，24h + 2h,36 + 1 ，24h + 2h,25 + 1 ，48h + 4h,阪崎肠杆菌检验程序,操作步骤,前增菌：预热900ml BPW至44 ，称样100g(100ml)，加入后缓缓摇动至充分溶解， 36 + 1 培养18 h + 2 h。 增菌: 移取前增菌液1ml种于10ml mLST-Vm肉汤， 44 +0.5 培养24 h + 2 h。,操作步骤,分离： 混匀经过培养的mLST-Vm，各取一环，分别划线2个DFI平板， 36 + 1 培养24 h + 2 h。 可疑菌落

10、特征（1mm3mm,蓝绿色），挑取15个划线接种于TSA板， 25 + 1 分纯培养48 h + 4 h。,图一 阪崎肠杆菌在DFI上的菌落生长特征,操作步骤,鉴定 TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定 可选择 API 20 或 VITEK,表一 阪崎肠杆菌的主要生化特征,注：“+”99%阳性；“-” 99%阴性；“（+）”90%99%阳性；“（-）”90%99%阴性,图二 阪崎肠杆菌 API 20E 生化鉴定,图三 阪崎肠杆菌API 20E 软件判读界面,第二法 阪崎肠杆菌的计数,操作步骤,样品的稀释 固体和半固态样品： 制备1 : 10样品匀液 无菌称样100 g、10 g、1

11、g各3份，加入预热至44 900 ml、90 ml、9 ml BPW中，轻轻摇动至充分溶解，36 + 1 培养18 h + 2 h。分别移取1 ml转种于10 ml mLST-Vm肉汤， 44 +0.5 培养24 h + 2 h。,操作步骤,液体样品 制备1:10样品匀液 无菌称样100 ml、10 ml、1 ml各3份，加入预热至44 900 ml、90 ml、9 ml BPW中，轻轻摇动至充分溶解，36 + 1 培养18 h + 2 h。分别移取1 ml转种于10 ml mLST-Vm肉汤， 44 +0.5 培养24 h + 2 h。,操作步骤,分离、鉴定 同第一法的分离鉴定方法,操作步骤

12、,阪崎肠杆菌计数的报告 综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查 MPN检索表（见附录B，表B.1） 报告每100g或100ml样品阪崎肠杆菌MPN值,风 险 评 估,微生物风险评估是一门发展中的学科，这门新学科应用于食源性致病菌的研究,有利于推动风险管理与风险交流。 建立定量微生物风险评估(Quantitative icrobiological risk assessment , QMRA) 的主要目的包括:模拟食物 链中由于食品消费引起致病菌感染的可能性;确定 食物链环节中可以采取的能够降低疾病风险的各种 管理措施,并对各种措施的效果进行评估,风 险 评 估,联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO) 于2006 年公布了婴儿配方粉( PIF) 阪崎肠杆菌定量风险评估模型。 我国对阪崎肠杆菌的风险性评估滞后于国标的执行，目前还没有相关的风险评估标准模型出台。,食品安全，宝宝健康，责任重大,欢迎您的参与 谢谢您的支持！,