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1、不同亚型转化生长因子(TGF-1、 TGF-2、TGF-3)对于 前软骨干细胞增殖分化增值活动的影响摘 要目的：前软骨干细胞作为一种组织工程学种子细胞被用于修复软骨损伤，近年来受到了越来越多的学者的关注。本文通过观察三种不同亚型的转化生长因子（TGF-）：TGF-1、TGF-2和TGF-3对于前软骨干细胞（PSCs）细胞增殖分化活动以及细胞外基质合成的影响并加以比较为构建组织工程学软骨组织以修复软骨损伤，寻找一种理想的细胞因子。方法：通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和纯化的PSCs细胞，使用含有浓度为10ng/ml的三种亚型的重组TGF-培养基对PSCs进行培养。采用MTT法与BrdU/PI 双
2、参法测不同组别PSCs培养后第0,3,6,9d细胞增殖及DNA合成水平，并采用rt-pcr法测定培养后第0，3，6，9天不同组别Col II,Aggrecan基因的表达情况。采用免疫组化法测定培养2周后各组细胞SOX9蛋白表达情况。结果：培养三天后与对照组相比使用TGF-1干预组的活性明显下降（P0.05）。6天后，与对照组相比较TGF-1组细胞增值活性明显降低(（P0.01），而TGF-2、3组则显示了相反的结果，使用TGF-2、3组细胞的增殖活性较对照组明显增前且TGF-3组高于TGF-2组（P0.05）。rt-pcr分析显示随着时间的延长，与空白对照组相比实验组A、B、C Col II基
3、因表达均呈上升趋势，然而使用TGF-1与TGF-3组Aggrecan的表达随时间延长而增加，但使用TGF-2组Aggrecan的基因表达无明显改变。免疫组化显示与对照组相比，TGF-1、TGF-3组的SOX9蛋白合成高于对照组（P0.05）。结论：TGF-1能抑制PSCs增殖活性，而TGF-2和TGF-3具有促进PSCs增殖的作用， TGF-1与TGF-3均能促进PSCs细胞分化，而TGF-2对于分化的诱导作用不明显。关键词前软骨干细胞，转化生长因子亚型，增殖与分化Study of the effect of Transforming Growth Factor Beta (TGF1, TGF
4、2 and TGF3) on the activities of proliferation and differentiation of precartilaginous stem cells（PSCs）AbstractObjective：Precartilaginous stem cells（PSCs）as a promising tissue engineeringseed cells to cure cartilage injury attach more and more importances from researchers recently. To observe the ef
5、fect of different TGF-isforms: TGF-1, TGF-2 and TGF-3 on the proliferation and differention of precartilaginous stem cells ( PSCs) and compare their capacity between each other，further more to find an ideal cytokineto construct tissue engineeringCartilage to repair Cartilage defect.Methods:obtain th
6、e PSCs by the ways of Immun-Magnetic activated cell sorting after seperation and purifcation. Culture PSCs in the medium with the concentration of 10ng/ml of different TGF- isfroms .Proliferation and DNA synthesisof PScs in response to TGF- isoforms was examined by MTS and BrdU / PI double-reference
7、 method at the time of 0,3,6,9d after be cultured. Observe the level of the gens expression of Col II,Aggrecan at the time of 0,3,6,9 d by means PT-PCR and expresion of SOX9 by means Immuno- histochemistry at the time of 2w to study the effects of TGF-1, TGF-2 and TGF-3 on chondrogenic differentiati
8、on. Results: After 3 d cultrued the activity of proliferation in group ofTGF-1 decreased significantly（P0.05）, after 6 d the activity of proliferation in group of TGF-1 decreased significantly comparing with the control group, but the group of TGF-2and TGF-3 show increasing effect on the proliferati
9、on of PSCs（P0.05）.RT-PCR shows:With the extension of time,the gen exprssions of Col II in each group of TGF- have the increasing inclinations, the gens exprssions ofAggrecan also appears increasing in the groups of TGF-1and TGF-3, but these gens expression show no difference in TGF-2 group. Immunohi
10、stochemistry shows the synthesis of SOX9 protein in groups of TGF-1、TGF-3 are higer than the control group（P0.05）.Conclusions:TGF-1 could inhibit the activity of proliferation in in PSCs and TGF-2 and TGF-3 can enhance the the activity of proliferation. Both TGF-1andTGF-3 could promote the different
11、iation of PSCs,while TGF-2 do not show that inductive effect.Keywords precartilaginous stem cells ( PSCs), Transforming growth factor- isoforms,proliferation and differentiation引言：软骨自我修复能力极为有限，尽管传统的手术治疗可以起到一定修复作用，但实际上髓腔及血液中的成软骨细胞无法到达损伤部位，进而增殖分化形成具有一定强度的软骨组织1，最终损伤部位将为纤维疤痕组织所替代，无法恢复关节正常的生理构造和功能。故软骨损伤的
12、治疗一直困扰者临床工作者，而利用组织工程的手段治疗软骨及骨骺损伤也成为前研究的热点。前软骨干细胞（PSCs）来源于由于其具有定向增殖分化为成熟软骨细胞能力，能作为一种较为理想的组织工程学种子细胞的为越来越多的研究工作者所重视。转化生长因子- (Transforming growth factor beta, TGF-)是一种多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-家族在调控胚胎源性干细胞增殖与分化中也起到极为重要的作用，它能通过提高Cox9基因转录上调骨髓间充质肝细胞软骨基因的表达，通过抑制Runx2基因转录从而阻止成骨细胞向分化2-3。, 转化生长因子-
13、包括5个亚型4，其中转化生长因子-1，转化生长因子-2和转化生长因子-3存在于哺乳动物体内5。三种亚型均具有能介导不同来源的间充质细胞分化形成软骨细胞的能力，但在对于不同类型的细胞中其诱导效应存在很大的差异性6-8，而对于PScs细胞细胞的诱导效应也尚未见相关报道。本试验旨在观察不同三种TGF-亚型细胞因子对于PScs细胞增值与分化的影响，并对三者的诱导能力加以比较，以寻找促进种子细胞分化增值的高效的细胞因子。1.材料与方法1.1 实验材料：实验动物选用12h内新生纯系清洁级雌性SD大鼠，体重8g左右。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：syxk（鄂）2009-0028
14、，乳鼠饲养在保持恒温23，恒湿（50%）的清洁动物饲养房内。1.2 试剂与仪器：重组TGF-1、 TGF-2、TGF-3 (Fitzgerald Industries, Concord, MA)DMEM培养基（Hyclone USA），Gibco优质胎牛血清（Gibco USA），MiniMACS磁珠细胞分选系统、羊抗兔IgG免疫磁珠（MiltenyiGer），兔多克隆抗体FGFR-3（SantaCruz USA），Trizol试剂盒（Invitrogen USA），反转录试剂盒（TOYOBOJPN），PCR引物由武汉Invitrogen公司代为合成，TaqMix DNA聚合酶（TOYOBOJ
15、PN），鼠抗人BrdU单克隆抗体（Sigma USA）, FITC荧光标记的二抗（DakoDEN）, 噻唑蓝（MTT）、二甲基亚枫(DMSO)（Sigma USA）流式细胞仪FACSort(Becton Dickson USA)，SABC试剂盒（上海富众生物公司）。1.3 实验方法：PSCs细胞的提取分离纯化与培养：由于FGFR-作为PSCs细胞特殊的表面标志物而被鉴定并故可通过免疫磁珠法进行分选纯化，具体方法：1、 新生SD 大鼠处死后，低倍显微镜视野下环行切取La Croix环，即新生动物骺板周围骨膜环形组织结构，仔细分离该环,剪成小块( 1 mm3 )。2、 型胶原酶消化1小时，密度梯度离心法去除死细胞，将收集到的细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM -F12培养基中，37.5，5%CO2培养箱中。3、 24h后使用缓冲液（PBS-0.5% BSA-2 mmol EDTA）将原代细胞悬浮后用30m 孔径过滤器去除聚集的细胞团制备成单细胞悬液。
